Совка встретила своего биологического киллера. Им оказался обычный почвенный гриб

Характеристика патогенности грибов рода Beauveria и Metarhizium в отношении кукурузной листовой совки Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae).Ранее мы оценили патогенность одиннадцати эндемичных энтомопатогенных грибов (ЭПГ), включая шесть изолятов Beauveria, четыре изолята Metarhizium и один M. pingshaense, в отношении сельскохозяйственного вредителя Spodoptera frugiperda (кукурузной листовой совки, КЛС). Мы обнаружили, что эффективными оказались четыре изолята Beauveria и один Metarhizium, причем изоляты Beauveria B-0571 и B-1311 вызывали высокую смертность в течение 24 часов после нанесения спор. Целью данного исследования была идентификация и характеристика механизмов энтомопатогенеза этих изолятов как потенциальных агентов биоконтроля КЛС.

Все изоляты Beauveria были определены как B. bassiana, а изоляты Metarhizium — как два M. robertsii, один M. majus и один неизвестный вид рода Metarhizium. Несмотря на высокую смертность, вызванную изолятами B-0571 и B-1311, сканирующая электронная микроскопия не выявила прорастания грибных спор на погибших личинках через 24 часа после нанесения.

У всех изолятов B. bassiana были идентифицированы и охарактеризованы четыре кластера генов, кодирующих инсектицидные соединения: бассианолид, боверицин, бовериолид и ооспорин. Предполагается, что эти соединения вносят вклад в высокие показатели ранней смертности КЛС. Идентификация и характеристика кластеров генов, кодирующих эти инсектицидные соединения, в изолятах B-0571 и B-1311 будут способствовать лучшему пониманию энтомопатогенности данных изолятов. Это понимание крайне важно для разработки этих изолятов ЭПГ в качестве устойчивой альтернативы для биоконтроля кукурузной листовой совки.

Кукурузная листовая совка (Spodoptera frugiperda, КЛС) является инвазивным ночным совковым мотыльком (Lepidoptera), впервые зарегистрированным в Австралии в начале 2020 года [1]. КЛС является высоко полифагом [2,3,4], наносящим существенный ущерб экономически важным культурам в результате питания личинок на листьях и плодах [5]. Следовательно, интродукция КЛС представляет значительный риск для сельского хозяйства Австралии, включая сорго, пшеницу, хлопок, сахарный тростник и различные овощные культуры [6,7,8]. Чтобы снизить зависимость от синтетических инсектицидов широкого спектра действия, существует значительный интерес к потенциальным вариантам биоконтроля как части стратегии интегрированной борьбы с вредителями (IPM) для помощи в смягчении ущерба от КЛС.

Энтомопатогенные грибы (ЭПГ) представляют собой группу грибов, которые заражают и убивают насекомых-хозяев и являются ценным ресурсом для естественной борьбы с вредителями [9,10]. ЭПГ повсеместно распространены в природе, и более 18 000 видов, как сообщается, проявляют энтомопатогенез [11]. Виды из порядка Hypocreales, включая роды Beauveria и Metarhizium, особенно хорошо известны своим потенциалом для биоконтроля и применения в устойчивых сельскохозяйственных практиках [12]. Это связано с простотой питательных сред и условий их культивирования, а также с их эффективностью [13]. Общий способ действия ЭПГ из порядка Hypocreales начинается с заражения насекомых через кутикулу [14]. Попав внутрь, грибы распространяются по телу насекомого, поглощая питательные вещества, необходимые для их роста, что приводит к гибели насекомого-хозяина [15,16,17]. Затем ЭПГ выходит из тела хозяина, спорулирует, и цикл повторяется [17]. Включение ЭПГ в состав IPM в сельском хозяйстве может способствовать устойчивости и служить альтернативой химическим инсектицидам, решая проблемы устойчивости к пестицидам, остатков инсектицидов на продукции и загрязнения окружающей среды.

В дополнение к способности паразитировать на видах-хозяевах, продукция инсектицидных биоактивных соединений также может быть ключевым фактором вирулентности ЭПГ. Известно, что грибы рода Beauveria продуцируют широкий спектр инсектицидных соединений, включая боверицин [18], бассиакридин [19], бассианолид [20], дипиколиновую кислоту [21], бовериолид [22] и другие [18,23,24]. Некоторые из этих соединений, включая боверицин [18,23], бассиакридин и бассианолид [20], показали эффективность против КЛС. Например, боверицин мог снизить популяцию клеток SF-9 (клеточная линия КЛС) на 50% в течение 48 часов даже при воздействии низкой дозы (2,5 ± 0,5 мкМ) [23]. Кроме того, другие метаболиты, например, ооспорин, могут подавлять иммунитет насекомых [21,25,26,27], что помогает другим метаболитам или самому ЭПГ синергетически захватывать тело насекомого-хозяина.

В нашем предыдущем исследовании [28] одиннадцать изолятов энтомопатогенных грибов были протестированы против КЛС на различных стадиях развития. Два изолята Beauveria, а именно B-0571 и B-1311, проявили высокую эффективность, вызывая 73,96 ± 7,85% и 62,08 ± 3,67% смертности у личинок КЛС 3-го возраста в течение 24 часов [28]. Учитывая скорость гибели личинок, было выдвинуто предположение, что способ действия этих изолятов может быть связан с продукцией инсектицидных соединений, а не с прямым паразитизмом. Следовательно, цель данного исследования — проверить эту гипотезу, а также идентифицировать и охарактеризовать соединения, продуцируемые этими двумя высоковирулентными изолятами Beauveria, B-0571 и B-1311, которые являются летальными для КЛС.

2.1. Грибные изоляты

Одиннадцать изолятов энтомопатогенных грибов были выбраны из коллекции грибов CSIRO за их эффективность против КЛС [28]. Это включает шесть изолятов видов Beauveria (B-0016, B-0077, B-0079, B-0571, B-0698 и B-1311), четыре изолята рода Metarhizium (M-0121-0123 и M-0999) и один изолят M. pingshaense (M-1000, JBCAUT000000000). Виды насекомых-хозяев, географическое происхождение и даты сбора грибов были ранее описаны [28].

Грибные изоляты были реактивированы и поддерживались на агаризованной среде Сабуро с 1% дрожжевого экстракта (SDAY; pH 5,6) и инкубировались при 28 ± 1 °C в темноте. Для дальнейшего исследования, после полного спорулирования грибов, споры собирали в соответствии с протоколом, описанным в [28].

2.2. Экстракция геномной ДНК и полное секвенирование генома

Высокомолекулярную геномную ДНК грибных изолятов экстрагировали с использованием протокола из [29]. Качество экстрагированной ДНК оценивали с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Life Technologies Corporation, Карлсбад, Калифорния, США), гель-электрофореза и NanoDrop® (Thermo Scientific™, Уолтем, Массачусетс, США). Экстрагированная ДНК была отправлена в Genomics WA, Западная Австралия, для подготовки библиотек и длительного секвенирования считываний с использованием секвенатора PacBio HiFi Sequel® II (Менло-Парк, Калифорния, США) с технологией SMRTBell.

2.3. Биоинформатический анализ

Считывания PacBio HiFi были собраны de novo с использованием сборщика Canu с параметрами по умолчанию [30] https://github.com/marbl/canu (дата обращения: 28 марта 2024 г.). Качество сборки анализировали с помощью BUSCO (Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs) [31] https://busco.ezlab.org/ (дата обращения: 30 апреля 2024 г.) с набором данных hypocreales_odb10 (порядок, включающий роды Beauveria и Metarhizium) и QUAST (QUality ASsessment Tool) [32] https://github.com/ablab/quast (дата обращения: 4 октября 2024 г.).

2.4. Идентификация видов и филогения

Родовая принадлежность грибных изолятов была ранее определена с помощью морфологии и секвенирования внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) [28]. Однако одной только области ITS недостаточно для определения видов грибов из родов Beauveria и Metarhizium [28,33,34]. Поэтому для помощи в процессе идентификации был применен подход типирования по множественным локусам (MLST) [33,34].

Для идентификации видов изолятов Beauveria для анализа MLST использовали последовательности четырех ДНК-маркеров: B-локусного межгенного участка ядерной ДНК (Bloc), наибольшей (RPB1) и второй по величине (RPB2) субъединиц РНК-полимеразы II, а также фактора элонгации трансляции (TEF). Для изолятов Metarhizium использовали семь ДНК-маркеров: ДНК-лиазу (APN2), бета-тубулин (BTUB), RPB1a, RPB1b, RPB2a, RPB2b и TEF. Последовательности маркеров были получены из полной последовательности генома. Референсные последовательности были взяты из [33] для Beauveria и [34] для Metarhizium, а также из баз данных NCBI.

Использовали последовательности двадцати референсных изолятов Beauveria (шесть видов, Таблица S1) и двадцати двух таксонов десяти видов Metarhizium (Таблица S2). Последовательности маркеров выравнивали с помощью MUSCLE с параметрами по умолчанию в программе Geneious Prime 2023.2.1 (Muscle 5.1 с алгоритмом: PPP). Филогенетическое размещение конкатенированных последовательностей методом максимального правдоподобия строилось с помощью веб-сервера IQ-TREE http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/ (дата обращения: 5 апреля 2024 г.) с автоматическим выбором оптимальной модели замещения и 1000 повторений ультрабыстрой бустрап-репликации [35] для оценки достоверности узлов. Филогенетические деревья редактировали с помощью iTOL v.6 <https://itol.embl.de/> (дата обращения: 5 апреля 2024 г.) [36].

2.5. Образцы насекомых и биологический анализ на насекомых

Вирулентность двух высоковирулентных грибных изолятов B-0571 и B-1311 проверяли на лабораторной колонии КЛС, первоначально созданной из 30 собранных в поле куколок, собранных на полевой станции, принадлежащей Университету Квинсленда (Рекс Роуд, Уолкамин, Квинсленд, Австралия) [37].

Биологический анализ на насекомых проводили в соответствии с протоколом в [28]. 32 личинки КЛС 3-го возраста обрабатывали 0,1% растворами Tween 80® в качестве контрольных образцов и суспензией спор B-0571 или B-1311 с концентрацией спор ≥ 10⁷ конидий/мл в качестве грибных образцов. Три гусеницы отбирали с 1-го по 7-й день (24 часа после обработки = день 1) и фиксировали в смеси этанол-уксусная кислота 3:1. Образцы хранили при комнатной температуре (21 ± 1 °C) для дальнейшего исследования.

2.6. Микроскопический анализ

Два наиболее высоковирулентных грибных кандидата, B-0571 и B-1311, были оценены микроскопически. Впоследствии внешняя морфология образцов была визуализирована в Центре микроскопии CSIRO Блэк Маунтин.

Для исследования внешней морфологии использовали сканирующую электронную микроскопию (СЭМ). Образцы сушили критической точкой (Autosamdri®-931, Tousimis, Роквилл, Мэриленд, США) и монтировали на алюминиевые штырьки с двухсторонними адгезивными углеродными дисками (IA0201, ProSciTech, Кирван, Квинсленд, Австралия). Затем образцы визуализировали с помощью СЭМ (ZEISS EVO LS 15, ZEISS Microscopy (Оберкохен, Германия)) с ускоряющим напряжением 10 кВ, вакуумом 10 Па и детектором обратнорассеянных электронов.

Для исследования внутренней морфологии образцы регидратировали через серию убывающих концентраций этанола (70, 50 и 25%) по 15 минут каждый. Затем образцы осветляли с помощью 10% (мас./об.) гидроксида калия (KOH) при 85 °C в течение 5–15 минут, время обработки варьировалось в зависимости от размера образца. Обработку прекращали, когда образцы достигали оптической прозрачности, сохраняя при этом структурную целостность. Затем образцы аккуратно промывали трижды в дистиллированной воде по 10 минут каждый раз. Впоследствии образцы окрашивали, замачивая в 20 мкг/мл агглютинина зародышей пшеницы, конъюгированного с тетраметилродаминизотиоцианатом-декстраном (WGA-TRITC, W849, Thermo Fisher Scientific), при комнатной температуре в течение 30 минут с периодическим легким встряхиванием. Образцы промывали дважды в дистиллированной воде и монтировали с использованием предметных и покровных стекол. Широкопольные изображения получали с помощью оптического микроскопа (ZEISS AxioImager Z1, ZEISS Microscopy), оснащенного светодиодным источником белого и флуоресцентного света (Colibri 7), цветной ПЗС-камерой ZEISS Axiocam 712 (ZEISS Microscopy) и объективами Plan-Apochromat 10× NA = 0,3 и 20× NA = 0,5. Использовали фильтры ZEISS 43 HE (DsRed, возбуждение BP550/25; делитель пучка FT 570 HE; эмиссия BP605/70 HE) и 02 (DAPI, возбуждение 365; делитель пучка 395; эмиссия LP 420) для визуализации WGA-TRITC и автофлуоресценции тканей соответственно. Захват изображений и постобработку осуществляли с помощью ZEN blue v3.2 (ZEISS Microscopy).

2.7. Предсказание кластеров генов биосинтеза

Кластеры генов биосинтеза (BGC) грибных изолятов предсказывали из их генома с помощью AntiSMASH – fungal version 7.0.1 (Antibiotics & Secondary Metabolite Analysis Shell [38]), доступного по адресу <https://fungismash.secondarymetabolites.org> (дата обращения: 13 октября 2023 г.). Строгость обнаружения была установлена на «relaxed», и все дополнительные функции (например, KnownClusterBlast и сравнение с кластерами MIBiG) были активированы. Соответственно, результаты были проверены вручную для подтверждения точности предсказания.

3.1. Идентификация видов

Геномы десяти изолятов были собраны, средние размеры варьировались от 37 до 39 Мб для изолятов Beauveria и от 42 до 45 Мб для изолятов Metarhizium, при этом полнота BUSCO составила 96,9–97% и 96,7–97,5% соответственно (Таблица S3). Исключением стал M-0999, чей геном был оценен как более крупный (101 Мб) и показал высокое количество дупликаций, с 88,5% дублированных BUSCO. Следовательно, полагают, что M-0999 обладает диплоидным геномом с гетерозиготностью.

Для идентификации видов шести изолятов Beauveria было построено филогенетическое дерево с использованием MLST четырех широко используемых ДНК-маркеров. Анализ показал, что эти изоляты Beauveria тесно связаны с восемью референсными последовательностями B. bassiana, так как они были сгруппированы в одном кладе. Эта группировка продемонстрировала высокие уровни достоверности узлов (100%), что выделено на Рисунке 1 красной рамкой.

Рисунок 1. Филогенетический анализ методом максимального правдоподобия шести изолятов Beauveria, включая B-0016, B-0077, B-0079, B-0571, B-0698 и B-1311 (выделены жирным). Все шесть изолятов Beauveria были сгруппированы с восемью референсными последовательностями B. bassiana с высокой достоверностью узлов (100%).

Филогенетическое размещение, установленное на основе семи ДНК-маркеров, использовали для помощи в определении видов четырех изолятов Metarhizium. Анализ сгруппировал M-0121 и M-0122 с четырьмя референсными последовательностями M. robertsii с сильной поддержкой бустрапа (99%, Рисунок 2, указано красной рамкой). Изолят M-0123 был размещен как сестринская ветвь к M. guizhouense, но с поддержкой узла только 63% (Рисунок 2, выделено желтым). Наконец, M-0999 был сгруппирован с тремя изолятами M. majus с достоверностью узла 100% (Рисунок 2, в синей рамке).

Рисунок 2. Филогенетическое размещение четырех изолятов Metarhizium (M-0121, M-0122, M-0123 и M-0999). Оба изолята M-0121 и M-0122 были сгруппированы с четырьмя референсными последовательностями M. robertsii (указано в красной рамке, значение бустрапа 99%). Изолят M-0123 был размещен как отдельная ветвь (выделено желтым), имея 63% достоверность узла с сестринским кладом M. guizhouense. Изолят M-0999, как показано, группируется с тремя референсными последовательностями M. majus с поддержкой узла 100% (показано в синей рамке).

3.2. Микроскопический анализ

3.2.1. Анализ внешней морфологии

Чтобы лучше понять патогенность высоковирулентных изолятов B. bassiana по отношению к КЛС, наблюдали внешнюю морфологию контрольных и обработанных грибами образцов. Результаты свидетельствуют, что прорастания спор в течение 24 часов после обработки не произошло. В то время как в контрольных образцах грибные споры не были обнаружены (Рисунок 3a,b), значительное количество грибных спор было видно на поверхности обработанных грибами образцов (Рисунок 3c–e). Споры в основном находились на телах насекомых (грудь и брюшко), меньше — на головах. Грибные споры располагались вокруг дыхалец (наружных дыхательных отверстий гусениц, Рисунок 3f); однако они, по-видимому, не блокировали дыхальца. Кроме того, грибные споры кажутся значительно меньше дыхалец насекомых.

Рисунок 3. Внешняя морфология контрольных (a,b) и обработанных грибами (c–h) гусениц КЛС третьего возраста. Живые контрольные образцы (0,1% (об./об.) раствор Tween 80®) и мертвые обработанные грибами образцы (B-0571 или B-1311 с концентрацией спор ≥ 107 конидий/мл) собирали с 1-го (a–e) по 7-й (g–h) день (24 часа после обработки = день 1). Образцы фиксировали в смеси этанол-уксусная кислота 3:1, а поверхностную морфологию тела насекомого (a,c,f), головы (b,d,g), дыхалец (e) и поверхности крупным планом (h) визуализировали с помощью СЭМ при увеличении 96–1,65 K×. Красные стрелки указывают на гифы/прорастание спор B. bassiana.

Семь дней после грибных обработок тела насекомых были покрыты гифами, которые можно было легко увидеть невооруженным глазом. Прорастание спор и признаки паразитизма были очевидны по всему насекомому (Рисунок 3f–h). На 7-й день после обработки контрольные образцы развились в гусениц 5-го–6-го возраста, демонстрируя заметную разницу в размере по сравнению с обработанными образцами. Поэтому контроль для 7-дневных обработанных грибами образцов собирали в первые 24 часа после обработки (Рисунок 3a,b). Для обработанных грибами образцов (Рисунок 3f–h) признаки грибного прорастания и паразитизма были обнаружены по всему телу насекомых, включая голову. Однако гифы, по-видимому, располагались в основном на теле.

3.2.2. Анализ внутренней морфологии

Чтобы обнаружить признаки грибного прорастания и паразитирования, внутреннюю морфологию обработанных гусениц третьего возраста исследовали с помощью оптического микроскопа. Контрольный образец показан на Рисунке 4 (Рисунок 4a, до осветления; Рисунок 4b–d, после осветления), а грибной образец показан на Рисунке 4e. Пятна в пищеварительном тракте 24-часовых грибных образцов (Рисунок 4e) были обнаружены, но они не появлялись в контрольных образцах. Эти пятна подозревались в том, что являются грибными спорами, хотя разрешение изображения было недостаточно высоким, чтобы позволить лучше подтвердить это или определить, начались ли ранние процессы прорастания спор. Следовательно, контрольные и грибные образцы окрашивали WGS-TRITC для помощи в подтверждении.

Рисунок 4. Внутренняя морфология контрольных (a–d) и обработанных грибами (e) личинок КЛС третьего возраста. Личинок обрабатывали 0,1% (об./об.) раствором Tween 80® для контрольных образцов или суспензией спор изолятов B-0571 или B-1311 (концентрация спор ≥ 107 конидий/мл) в качестве грибных образцов. Образцы осветляли 10% KOH при 85 °C в течение 10–15 минут. Внутреннюю морфологию образцов регистрировали до (a) и после (b–e) процесса осветления с помощью оптического микроскопа. Масштабная линейка на рисунке (c) указывает 0,64 мм. Фотографии были сделаны с помощью оптического микроскопа при белом свете. Предполагаемые грибные споры в обработанных образцах указаны красной стрелкой (e).

Флуоресцентный краситель WGS-TRITC окрашивал как кутикулу насекомого, так и клеточные стенки грибных спор в контрольных (Рисунок 5a,b) и грибных образцах (Рисунок 5c,d). Отчетливые пятна появились в пищеварительных трактах гусениц, обработанных грибами (Рисунок 5c,d), но отсутствовали в контроле (Рисунок 5a,b). Таким образом, полагают, что эти пятна являются грибными спорами. Однако признаков прорастания в 24-часовых грибных образцах обнаружено не было (Рисунок 5d).

Рисунок 5. Флуоресцентные изображения окрашивания WGA-TRITC контрольных (a,b) и обработанных грибами (c,d) личинок КЛС третьего возраста. Живых гусениц КЛС третьего возраста, обработанных 0,1% (об./об.) раствором Tween 80® (контрольные образцы), и мертвых гусениц, обработанных суспензией спор изолятов B-0571 или B-1311 (≥107 конидий/мл), собирали через 24 часа после обработки (N = 3). Образцы осветляли 10% KOH и окрашивали WGA-TRITC. Флуоресцентный сигнал регистрировали с помощью оптического микроскопа, используя наборы фильтров ZEISS DsRed и DAPI. Окрашенные пятна грибной клеточной стенки указаны белыми стрелками на (c,d).

3.3. Предсказание кластеров генов биосинтеза

В шести изолятах B. bassiana было распознано 43–51 кластеров генов биосинтеза (BGC), а в пяти изолятах Metarhizium — 56–111. Хотя многие остаются неизвестными, 13–16 BGC из B. bassiana и 24–42 из Metarhizium spp. имеют сходство с референсными кластерами из базы данных MIBiG (Minimum Information about a Biosynthesis Gene cluster). Кластеры, имеющие более 50% сходства с референсными кластерами из базы данных MIBiG, перечислены в Таблице S4.

3.3.1. Beauveria bassiana

Среди известных BGC, обнаруженных в протестированных изолятах B. bassiana, есть доказательства, свидетельствующие, что некоторые обладают инсектицидными свойствами. Это включает бассианолид, боверицин и бовериолид. Хотя ооспорин не проявляет инсектицидных свойств, было показано, что он подавляет иммунный ответ у насекомых [25], что также обсуждается далее ниже.

Бассианолид

Кластер генов бассианолида был обнаружен во всех протестированных изолятах B. bassiana, причем весь их кластер имел сходство 53–66% с референсным генным кластером (BGC0000312 из B. bassiana, Таблица 1). Все эти кластеры содержали ключевой ген биосинтеза для продукции бассианолида (bsls), при этом изоляты B. bassiana проявляли 85–97% сходства с референсным bsls.

Боверицин

Все протестированные изоляты B. bassiana также обладают одним кластером генов боверицина, причем кластеры демонстрируют 70–90% сходства с зарегистрированным в MIBiG кластером (BGC0000313 из B. bassiana, Таблица 1). Ключевой ген биосинтеза, беоверицин-нерибосомальная циклодепсипептид синтетаза (Beas), обнаружен во всех изолятах B. bassiana, показывая 88–97% сходства.

Бовериолид B/C/D

Кластер генов для бовериолида B/C/D был распознан во всех протестированных изолятах B. bassiana, весь кластер демонстрировал сходство от 66% до 83% по сравнению с референсным кластером (BGC0002203 из B. bassiana, Таблица 1). Кластер генов бовериолида B/C/D содержал два ключевых гена биосинтеза, BesA и BesB. Эти два гена были обнаружены во всех изолятах B. bassiana. Однако BesA трех изолятов, включая B-0077, B-0079 и B-1311, по-видимому, содержит вставку неизвестной последовательности (132 нуклеотида (нт), Рисунок 6). Сходство nrps в изолятах B. bassiana с зарегистрированным геном колеблется от 81% до 97%, в то время как для гена BesB оно составляет от 95 до 96%.

Ооспорин

Во всех протестированных изолятах B. bassiana обнаружен кластер генов ооспорина. Хотя они не идентичны, все они имеют 85% сходства по всему кластеру по сравнению с референсным кластером (BGC0001720 из B. bassiana, Таблица 1). Для ключевого гена биосинтеза они имели 89–92% сходства по сравнению с референсным геном. Однако у B-0077 и B-1311 был неполный ген транспорта, и предстоит исследовать, повлияет ли это на продукцию ооспорина.

Таблица 1. Кластеры генов инсектицидных соединений, предсказанные в грибных изолятах.

Рисунок 6. Сравнение кластеров генов бовериолида B/C/D, идентифицированных в изолятах B. bassiana (B-0016, B-0077, B-0079, B-0571, B-0698 и B-1311) с референсным кластером генов бовериолида из MIBiG (BGC0002203 из B. bassiana). Кластеры генов бовериолида B/C/D предсказаны из геномов изолятов B. bassiana. Ключевые гены биосинтеза выделены красным; дополнительные гены биосинтеза окрашены в розовый цвет, а неспецифические гены затенены серым. Источник: изменено из рисунка, сгенерированного antiSMASH 7.0.1.

3.3.2. Виды Metarhizium

Среди грибных изолятов были идентифицированы четыре различных вида Metarhizium (Рисунок 2; см. также [28]), каждый из которых демонстрировал значительную вариабельность в своих BGC. В этом исследовании мы сосредоточились на одном конкретном изоляте, M-0121 (M. robertsii), из-за наивысшей эффективности, продемонстрированной против КЛС по сравнению с другими протестированными изолятами Metarhizium [28]. Два кластера генов инсектицидных соединений, т.е. деструксин и энниатин, были идентифицированы в M-0121 и будут дальнейшем обсуждены ниже.

Деструксин

Кластер генов деструксина (Dtx) обнаружен только в геноме M-0121, причем весь кластер имеет 76% сходства с зарегистрированным кластером (BGC0000337 из M. robertsii). BGC0000337 имеет два ключевых гена биосинтеза, т.е. nrps GliP-like и DtxS1. Однако только DtxS1 обнаружен в M-0121 с 98% сходства (Рисунок 7). Кроме того, ключевые гены биосинтеза DtxS2, DtxS3 и DtxS4 также отсутствуют в изоляте M-0121.

Рисунок 7. Кластеры генов для деструксина, предсказанные из генома M-0121 и референсного кластера MIBiG BGC0000337 из M. robertsii, сравниваются. Референсный кластер был идентифицирован как имеющий все компоненты, необходимые для производства деструксина (полный кластер). Дополнительные гены синтеза указаны розовым, ключевые гены биосинтеза красным, а гены, связанные с транспортом, синим. Источник: изменено из рисунка, сгенерированного antiSMASH 7.0.1.

Энниатин

Зарегистрированный кластер генов энниатина (BGC0000342 из Fusarium equiseti) содержит только один ген: esyn1. Хотя esyn1 обнаружен в четырех изолятах Metarhizium, включая M-0121, M-0122, M-0999 и M-1000, esyn1 в этих изолятах содержит менее половины длины зарегистрированного esyn1 (Рисунок 8). Более того, процент сходства их ключевого гена биосинтеза составляет всего 51–52%. Следовательно, кластеры генов энниатина в изолятах Metarhizium являются неполными, и предполагается, что они, возможно, не способны продуцировать энниатин.

Рисунок 8. Сравнение кластеров генов энниатина, предсказанных из геномов четырех видов Metarhizium spp. (т.е. M-0121, M-0122, M-0999 и M-1000) с референсным кластером Fusarium equiseti BGC0000342 из MIBiG. Синий цвет указывает на гены, связанные с транспортом, розовый обозначает дополнительные гены биосинтеза, а красный представляет ключевые гены биосинтеза. Источник: изменено из рисунка, сгенерированного antiSMASH 7.0.1.

4.1. Идентификация видов

Мы пришли к выводу, что шесть изолятов Beauveria (т.е. B-0016, B-0077, B-0079, B-0571, B-0698 и B-1311), вероятно, представляют разные изоляты B. bassiana на основе анализа MLST.

Филогенетические результаты свидетельствуют, что среди протестированных изолятов Metarhizium есть четыре вида. M-0121 и M-0122 сгруппированы с различными изолятами M. robertsii, что предполагает, что эти два изолята, вероятно, также являются M. robertsii. Видовая принадлежность M-0123, однако, осталась неопределенной, поскольку M-0123 в настоящее время является единственным образцом, базальным по отношению к M. guizhouense, но отличным от M. indigotica. Потребуется больше последовательностей (которые в настоящее время недоступны) от других близкородственных видов, чтобы лучше определить видовой статус изолята M-0123. Наконец, изолят M-0999, вероятно, является M. majus, так как он сгруппирован с тремя другими изолятами M. majus.

4.2. Микроскопический анализ

Внешняя и внутренняя морфология мертвых образцов, обработанных B-0571 или B-1311, указывает на то, что прорастания грибов в течение 24 часов после обработки не произошло. Хотя на поверхности гусениц было обнаружено много грибных спор, они, по-видимому, не блокировали дыхательные отверстия насекомых. Следовательно, причиной гибели насекомых вряд ли является грибной паразитизм или гипоксия. Мы предполагаем, что эти грибные кандидаты продуцируют биоактивные соединения с инсектицидными свойствами, вредными для личинок КЛС. В дополнение, для наблюдения за внутренней морфологией гусениц использовали оптическую световую и флуоресцентную микроскопию. Споры из B-0571 и B-1311 были обнаружены в пищеварительных трактах гусениц, что предполагает, что эти инсектицидные биоактивные соединения, возможно, требуют перорального проглатывания для проявления эффективности. Эта гипотеза подтверждается отсутствием эффективности B-0571 и B-1311 против куколок и взрослых особей в первые 24 часа [28], поскольку эти поздние стадии имеют сниженное или отсутствующее потребление пищи.

4.3. Предсказание кластеров генов биосинтеза

Чтобы лучше понять геномную основу высокой вирулентности, наблюдаемой у ранее протестированных грибных изолятов, включая продукцию соединений, вредных для КЛС, их BGC были аннотированы и охарактеризованы. Наши результаты подчеркивают, что четыре инсектицидных BGC были распознаны во всех протестированных изолятах B. bassiana. Это включает бассианолид, боверицин, бовериолид B/C/D и ооспорин. Предполагается, что по крайней мере одно из этих соединений экспрессируется в высоковирулентных изолятах (т.е. B-0571 и B-1311). В случае B-0077, B-0079 и B-1311 ген besA в пределах кластера генов бовериолида B/C/D был нарушен. Этот кластер содержал два основных ключевых гена биосинтеза, а именно besA и besB. Исследование Yin и др. [39] показало, что эти гены, вероятно, ответственны за продукцию различных аналогов бовериолида. Кроме того, нет исследований, сравнивающих вирулентность мутантов ΔbsA с диким типом. Следовательно, эффекты нарушения besA на B-0077, B-0078 и B-1311, такие как то, экспрессируют ли эти изоляты все еще функциональный BesA, и как отсутствие BesA может повлиять на вирулентность этих изолятов, остаются предметом дальнейшего исследования. Кроме того, функция более половины BGC, предсказанных в B. bassiana, осталась неидентифицированной. Оставшаяся возможность состоит в том, что некоторые из них могут кодировать соединения с инсектицидными свойствами.

Для M-0121, изолята с наивысшей вирулентностью среди протестированных изолятов Metarhizium, были обнаружены два кластера генов инсектицидных соединений: Dtx и энниатин. Однако кластеры генов энниатина, по-видимому, были неполными, и поэтому было выдвинуто предположение, что они либо не продуцируют энниатин, либо, возможно, производят неизвестные соединения. Кластер генов Dtx, по-видимому, отличался от референсного кластера генов, отсутствовал один из ключевых генов и многие дополнительные гены биосинтеза. Работа Wang и коллег [40] предполагает, что отсутствие DtxS2, DtxS3 и DtxS4, которые кодируют ферменты цитохрома P450, альдо/кето-редуктазы и декарбоксилазы соответственно, влияет на продукцию Dtx, снижая способность превращать Dtx B в Dtx A, C, D и E, и значительно снижает его вирулентность против насекомых. Однако эффект отсутствующего гена nrps GliP-like все еще неизвестен. Следовательно, продукция Dtx B в M-0121 остается неизвестной. В дополнение, как и в случае с изолятами B. bassiana, могут существовать неидентифицированные инсектицидные соединения, продуцируемые M-0121. В качестве альтернативы, вирулентность M-0121 может не зависеть от инсектицидных соединений, а от другого фактора, который еще предстоит определить.

Здесь были идентифицированы шесть видов Beauveria и четыре вида Metarhizium. Все изоляты Beauveria были идентифицированы как B. bassiana. Среди изолятов Metarhizium два были идентифицированы как M. robertsii, один как M. majus и один как неизвестный вид. Мы проанализировали энтомопатогенность двух высокоэффективных изолятов B. bassiana (т.е. B-0571 и B-1311) с помощью микроскопии, при этом результаты показали отсутствие прорастания грибов в мертвых, обработанных грибами гусеницах КЛС через 24 часа. Отсутствие грибного прорастания указывало на то, что вирулентность грибных кандидатов, вероятно, зависела от факторов, отличных от паразитирования. Эти факторы могут включать продукцию соединений с инсектицидными свойствами. Аннотация и характеристика предсказанных кластеров генов вторичных метаболитов в этих грибных изолятах выявили четыре кластера генов инсектицидных соединений во всех изолятах B. bassiana. Предполагается, что по крайней мере одно из этих соединений способствует вирулентности B-0571 и B-1311. Дальнейшие исследования, такие как транскриптомные, метаболомные или протеомные исследования, будут необходимы для подтверждения этой гипотезы и для лучшего понимания механизмов вирулентности этих грибных изолятов.

Помимо изолятов M-0121 и M-0122, другие изоляты Metarhizium были разными видами и могут проявлять различные уровни вирулентности по отношению к КЛС. Кроме того, кластер генов инсектицида (т.е. Dtx) был обнаружен только в M-0121, который проявил наивысшую эффективность среди изолятов Metarhizium. Поэтому предполагается, что экспрессия кластера генов Dtx лежит в основе превосходной эффективности M-0121 по сравнению с другими изолятами Metarhizium.

Открытие и характеристика двух высоковирулентных ЭПГ, нацеленных на КЛС, открывает перспективные новые возможности для разработки устойчивых инструментов управления вредителями. Лучшее понимание их энтомопатогенных свойств позволяет применять эти изоляты напрямую, или их производные токсины могут быть использованы в качестве агентов биоконтроля. Их можно использовать в качестве самостоятельных обработок или интегрировать с существующими подходами к борьбе с вредителями. Этот прогресс обладает потенциалом предоставить более эффективные и устойчивые решения для смягчения воздействия КЛС на культуры, что в конечном итоге приведет к улучшению продуктивности и качества сельскохозяйственных культур.

Дополнительные материалы

Следующая вспомогательная информация может быть загружена по адресу https://www.mdpi.com/article/10.3390/agriculture15020170/s1. Таблица S1: Информация о видах Beauveria, включая их происхождение, хозяина и регистрационные номера, использованных в этом исследовании; Таблица S2: Штаммы, использованные в филогенетическом анализе Metarhizium, включая географию, хозяина и номера GenBank; Таблица S3: Сводка сборки генома грибных изолятов; Таблица S4: Кластеры генов биосинтеза грибных кандидатов и их сходство с референсными кластерами MIBiG.

1.    Rane, R.; Walsh, T.K.; Lenancker, P.; Gock, A.; Dao, T.H.; Nguyen, V.L.; Khin, T.N.; Amalin, D.; Chittarath, K.; Faheem, M.; et al. Complex multiple introductions drive fall armyworm invasions into Asia and Australia. Sci. Rep. 2023, 12, 660. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

2.    Luginbill, P. The Fall ArmyWorm; U.S. Department of Agriculture: Washington, DC, USA, 1928; pp. 1–91. [Google Scholar]

3.    Sparks, A.N. A Review of the Biology of the Fall Armyworm. Fla. Entomol. 1979, 62, 82. [Google Scholar] [CrossRef]

4.    Sisay, B.; Sevgan, S.; Weldon, C.W.; Krüger, K.; Torto, B.; Tamiru, A. Responses of the Fall Armyworm (Spodoptera frugiperda) to Different Host Plants: Implications for Its Management Strategy. Pest Manag. Sci. 2023, 79, 845–856. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

5.    Day, R.; Abrahams, P.; Bateman, M.; Beale, T.; Clottey, V.; Cock, M.; Colmenarez, Y.; Corniani, N.; Early, R.; Godwin, J.; et al. Fall Armyworm: Impacts and Implications for Africa. Outlooks Pest Manag. 2017, 28, 196–201. [Google Scholar] [CrossRef]

6.    Agriculture and Fisheries. Fall Armyworm. Available online: https://www.business.qld.gov.au/industries/farms-fishing-forestry/agriculture/biosecurity/plants/insects/field-crop/fall-armyworm (accessed on 26 June 2024).

7.    Department of Energy, Environment and Climate Action, Agriculture Victoria. Fall Armyworm—Agriculture. Available online: https://agriculture.vic.gov.au/biosecurity/pest-insects-and-mites/priority-pest-insects-and-mites/fall-armyworm (accessed on 1 July 2024).

8.    Department of Primary Industries and Regional Development, Government of Western Australia. Fall Armyworm in Western Australia. Available online: https://www.agric.wa.gov.au/fall-armyworm-western-australia?nopaging=1 (accessed on 29 June 2024).

9.    Shah, P.A.; Pell, J.K. Entomopathogenic Fungi as Biological Control Agents. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 61, 413–423. [Google Scholar] [CrossRef]

10. Araújo, J.P.M.; Hughes, D.P. Diversity of Entomopathogenic Fungi: Which Groups Conquered the Insect Body? Adv. Genet. 2016, 94, 1–39. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

11. Marin-Felix, Y.; Groenewald, J.Z.; Cai, L.; Chen, Q.; Marincowitz, S.; Barnes, I.; Bensch, K.; Braun, U.; Camporesi, E.; Damm, U.; et al. Genera of Phytopathogenic Fungi: GOPHY 1. Stud. Mycol. 2017, 86, 99–216. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

12. Litwin, A.; Nowak, M.; Różalska, S. Entomopathogenic Fungi: Unconventional Applications. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 2020, 19, 23–42. [Google Scholar] [CrossRef]

13. Chandler, D. Chapter 5—Basic and Applied Research on Entomopathogenic Fungi. In Microbial Control of Insect and Mite Pests; Lacey, L.A., Ed.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2017; pp. 69–89. ISBN 978-0-12-803527-6. [Google Scholar]

14. Altinok, H.H.; Altinok, M.A.; Koca, A.S. Modes of action of entomopathogenic fungi. Curr. Trends Nat. Sci. 2019, 8, 117–124. [Google Scholar]

15. Dar, S.A.; Rather, B.A.; Kandoo, A.A. Insect Pest Management by Entomopathogenic Fungi. J. Entomol. Zool. Stud. 2017, 5, 1185–1190. [Google Scholar]

16. Trakimas, G.; Krams, R.; Krama, T.; Kortet, R.; Haque, S.; Luoto, S.; Eichler Inwood, S.; Butler, D.M.; Jõers, P.; Hawlena, D.; et al. Ecological Stoichiometry: A Link Between Developmental Speed and Physiological Stress in an Omnivorous Insect. Front. Behav. Neurosci. 2019, 13, 42. [Google Scholar] [CrossRef]

17. Mondal, S.; Baksi, S.; Koris, A.; Vatai, G. Journey of Enzymes in Entomopathogenic Fungi. Pac. Sci. Rev. A Nat. Sci. Eng. 2016, 18, 85–99. [Google Scholar] [CrossRef]

18. Caloni, F.; Fossati, P.; Anadón, A.; Bertero, A. Beauvericin: The Beauty and the Beast. Environ. Toxicol. Pharmacol. 2020, 75, 103349. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

19. Quesada-Moraga, E.; Vey, A. Bassiacridin, a Protein Toxic for Locusts Secreted by the Entomopathogenic Fungus Beauveria bassiana. Mycol. Res. 2004, 108, 441–452. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

20. Rosas-García, N.M.R.; Martínez, M.M.; Villegas-Mendoza, J.M. Detección de bassianolida y beauvericina en cepas de Beauveria bassiana y su participación en la actividad patogénica hacia Spodoptera sp. Biotecnia 2020, 22, 93–99. [Google Scholar] [CrossRef]

21. Cheong, P. Bioactive Metabolites of an Isolate of the Entomopathogenic Fungus Beauveria bassiana. Ph.D. Thesis, Lincoln University, Lincoln, New Zealand, 2015. [Google Scholar]

22. Kim, J.-C.; Hwang, I.M.; Kim, H.M.; Kim, S.; Shin, T.S.; Woo, S.-D.; Park, H.W. Rapid Analysis of Insecticidal Metabolites from the Entomopathogenic Fungus Beauveria bassiana 331R Using UPLC-Q-Orbitrap MS. Mycotoxin Res. 2024, 40, 123–132. [Google Scholar] [CrossRef]

23. Fornelli, F.; Minervini, F.; Logrieco, A. Cytotoxicity of Fungal Metabolites to Lepidopteran (Spodoptera frugiperda) Cell Line (SF-9). J. Invertebr. Pathol. 2004, 85, 74–79. [Google Scholar] [CrossRef]

24. Kanaoka, M.; Isogai, A.; Murakoshi, S.; Ichinoe, M.; Suzuki, A.; Tamura, S. Bassianolide, a New Insecticidal Cyclodepsipeptide from Beauveria bassiana and Verticillium lecanii. Agric. Biol. Chem. 1978, 42, 629–635. [Google Scholar] [CrossRef]

25. Feng, P.; Shang, Y.; Cen, K.; Wang, C. Fungal Biosynthesis of the Bibenzoquinone Oosporein to Evade Insect Immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 11365–11370. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

26. Altimira, F.; Arias-Aravena, M.; Jian, L.; Real, N.; Correa, P.; González, C.; Godoy, S.; Castro, J.F.; Zamora, O.; Vergara, C.; et al. Genomic and Experimental Analysis of the Insecticidal Factors Secreted by the Entomopathogenic Fungus Beauveria pseudobassiana RGM 2184. J. Fungi 2022, 8, 253. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

27. Abendstein, D.; Schweigkofler, W.; Strasser, H. Study on Insecticidal, Antifeedant and Growth Inhibitory Properties of Oosporein on Selected Pest Organisms. Insect Pathog. Insect Parasit. Nematodes 2003, 26, 103–106. [Google Scholar]

28. Apirajkamol, N.; Hogarty, T.M.; Mainali, B.; Taylor, P.W.; Walsh, T.K.; Tay, W.T. Virulence of Beauveria Sp. and Metarhizium Sp. Fungi towards Fall Armyworm (Spodoptera frugiperda). Arch. Microbiol. 2023, 205, 328. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

29. Apirajkamol, N.; Tay, W.T.; Mainali, B.; Taylor, P.; Walsh, T.K. High Molecular Weight DNA Extraction from Fungal Spores for Long Read Sequencing. Protocol.io. 2024. Available online: https://doi.org/10.17504/protocols.io.n92ld8ybnv5b/v1 (accessed on 11 April 2024).

30. Nurk, S.; Walenz, B.P.; Rhie, A.; Vollger, M.R.; Logsdon, G.A.; Grothe, R.; Miga, K.H.; Eichler, E.E.; Phillippy, A.M.; Koren, S. HiCanu: Accurate Assembly of Segmental Duplications, Satellites, and Allelic Variants from High-Fidelity Long Reads. Genome Res. 2020, 30, 1291–1305. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

31. Simão, F.A.; Waterhouse, R.M.; Ioannidis, P.; Kriventseva, E.V.; Zdobnov, E.M. BUSCO: Assessing Genome Assembly and Annotation Completeness with Single-Copy Orthologs. Bioinformatics 2015, 31, 3210–3212. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

32. Gurevich, A.; Saveliev, V.; Vyahhi, N.; Tesler, G. QUAST: Quality Assessment Tool for Genome Assemblies. Bioinformatics 2013, 29, 1072–1075. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

33. Rehner, S.A.; Minnis, A.M.; Sung, G.-H.; Luangsa-ard, J.J.; Devotto, L.; Humber, R.A. Phylogeny and Systematics of the Anamorphic, Entomopathogenic Genus Beauveria. Mycologia 2011, 103, 1055–1073. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

34. Kepler, R.M.; Humber, R.A.; Bischoff, J.F.; Rehner, S.A. Clarification of Generic and Species Boundaries for Metarhizium and Related Fungi through Multigene Phylogenetics. Mycologia 2014, 106, 811–829. [Google Scholar] [CrossRef]

35. Trifinopoulos, J.; Nguyen, L.-T.; von Haeseler, A.; Minh, B.Q. W-IQ-TREE: A Fast Online Phylogenetic Tool for Maximum Likelihood Analysis. Nucleic Acids Res. 2016, 44, W232–W235. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

36. Letunic, I.; Bork, P. Interactive Tree of Life (iTOL) v5: An Online Tool for Phylogenetic Tree Display and Annotation. Nucleic Acids Res. 2021, 49, W293–W296. [Google Scholar] [CrossRef]

37. Tay, W.T.; Rane, R.V.; James, W.; Gordon, K.H.J.; Downes, S.; Kim, J.; Kuniata, L.; Walsh, T.K. Resistance Bioassays and Allele Characterization Inform Analysis of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) Introduction Pathways in Asia and Australia. J. Econ. Entomol. 2022, 115, 1790–1805. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

38. Blin, K.; Shaw, S.; Augustijn, H.E.; Reitz, Z.L.; Biermann, F.; Alanjary, M.; Fetter, A.; Terlouw, B.R.; Metcalf, W.W.; Helfrich, E.J.N.; et al. antiSMASH 7.0: New and Improved Predictions for Detection, Regulation, Chemical Structures and Visualisation. Nucleic Acids Res. 2023, 51, W46–W50. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

39. Yin, Y.; Chen, B.; Song, S.; Li, B.; Yang, X.; Wang, C. Production of Diverse Beauveriolide Analogs in Closely Related Fungi: A Rare Case of Fungal Chemodiversity. mSphere 2020, 5, 10–1128. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

40. Wang, B.; Kang, Q.; Lu, Y.; Bai, L.; Wang, C. Unveiling the Biosynthetic Puzzle of Destruxins in Metarhizium Species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, 1287–1292. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Apirajkamol N, Mainali B, Taylor PW, Walsh TK, Tay WT. Characterisation of the Pathogenicity of Beauveria sp. and Metarhizium sp. Fungi Against the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). Agriculture. 2025; 15(2):170. https://doi.org/10.3390/agriculture15020170

Перевод статьи «Characterisation of the Pathogenicity ofBeauveriasp. andMetarhiziumsp. Fungi Against the Fall Armyworm,Spodoptera frugiperda(Lepidoptera: Noctuidae)» авторов Apirajkamol N, Mainali B, Taylor PW, Walsh TK, Tay WT., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык