ДНК-паспорт галисийского хлеба: как генетика защищает оригинальный продукт PGI

Генетическое разнообразие местной пшеницы (Triticum aestivum L.) и система Traceability in the Production для отслеживания производства Галисийского хлеба  (Защищённое географическое указание - PGI) с использованием микросателлитных маркеров.

Галисийская пшеница (Triticum aestivum L.) является основой для Галисийского хлеба — традиционного испанского продукта, имеющего статус Защищённого географического указания (PGI, схема качества ЕС). Основная коллекция этой пшеницы сохраняется в Сельскохозяйственном исследовательском центре Мабегондо (CIAM), Ксиунта де Галисия, А-Корунья, Испания. В данном исследовании было оценено 20 экотипов и сортов в сравнении с 4 эталонными образцами галисийской пшеницы и 14 коммерческими сортами. Семнадцать маркеров простых последовательных повторов (SSR, или микросателлитов) были использованы для изучения генетической структуры, определения происхождения и дифференциации от коммерческих сортов с целью обеспечения прослеживаемости.

Всего был проанализирован 291 образец пшеницы, выявлено 156 уникальных генотипов, 13 из которых принадлежали коммерческим сортам, а 143 — местным сортам и экотипам. SSR-локусы выявили 221 микросателлитный аллель, в среднем 11 аллелей на локус. Из них 151 аллель был обнаружен у местных сортов и экотипов, а 134 — у коммерческих сортов; 65 и 50 аллелей были уникальными для каждой группы соответственно.

Анализ с помощью программного обеспечения Structure продемонстрировал существенную генетическую дифференциацию (Fst = 0.26) между двумя основными кластерами: RPP1 (включает коммерческие сорта и два экотипа, 41 и 43) и RPP2 (включает местные сорта, элитные линии и экотипы). Более того, анализ дерева соседнего объединения и анализ главных компонент (PCA) подтвердили высокую степень дифференциации между этими кластерами, подчеркивая уникальность галисийской пшеницы, что полезно для прослеживаемости Галисийского хлеба.

Кроме того, SSR-маркеры оказались эффективными для отслеживания использования галисийской пшеницы, которая демонстрировала специфические галисийские аллели, в образцах муки, закваски и хлеба. Эти результаты подтверждают предыдущие выводы, даже при включении в анализ большего числа галисийских экотипов.

Пшеница (Triticum aestivum L., 2n = 6x = 42, 17 Gb, геномы AABBDD) — это однодольное растение семейства Poaceae. Она играет ключевую роль в питании человека, обеспечивая примерно 20% ежедневного потребления белка и калорий населением земного шара [1]. Уникальные вязкоупругие свойства белков глютена делают пшеницу основным ингредиентом в производстве хлеба [2]. Согласно прогнозам, мировой спрос на пшеницу к 2050 году возрастет на 50% [3,4,5].

Хлебная пшеница занимает второе место среди наиболее широко возделываемых злаков в мире. В Испании, в частности, наблюдается значительная изменчивость местных сортов хлебной пшеницы, что объясняется разнообразием климатов и типов почв в стране [6]. Однако в некоторых популяциях хлебной пшеницы наблюдалась значительная степень смешения [1].

Галисия — регион на северо-западе Испании, где на местных сельскохозяйственных полях сохранилось производство экотипов хлебной пшеницы, связанное со старой традицией изготовления хлеба из местной пшеницы [7]. Хотя в настоящее время она имеет небольшое значение в производстве пшеницы на национальном уровне, отвечая за 0.66% посевных площадей пшеницы и производства зерна [8], она имела высокое историческое значение в производстве пшеницы и других злаков со времен неолита (2300–2070 гг. до н.э.), что демонстрируют образцы пыльцы и карпологические образцы [9,10]. Лагаска и Клементе в своем гербарии начала XIX века ссылались только на Triticum turgidum из Галисии [11]; позже Планельяс включил другие виды Triticum в свою работу [12]. В XX веке в работе по галисийской флоре были описаны три разновидности голозерной пшеницы Triticum, которые сегодня были бы отнесены к T. aestivum L. ssp. aestivum, Triticum turgidum L. ssp. Turgidum и Triticum turgidum L. durum (Desf.) [13], причем последнее упоминание относилось к тетраплоидной пшенице. Однако ни одна из них не была пленчатой; это были голозерные формы с прочным стерженьком. Гадеа, Санчес-Монхе, Саукильо и Фрага Вила и Уркихо [14,15,16,17] ссылались на некоторые другие разновидности Triticum aestivum L. из региона Галисия, описывая различные собранные ботанические разновидности. Из этих последних работ [14,15,16,17] можно сделать вывод, что местные названия связаны с некоторыми морфологическими или физиологическими качествами разновидности, иногда отсылая ко времени посева или району, где их выращивают. В прошлом веке не было сообщений о следах тетраплоидной пшеницы или пленчатых разновидностей пшеницы, включая полбу и спельту, упомянутых в предыдущих работах [17].

Одной из главных задач Аграрного исследовательского центра Мабегондо (CIAM), Ксиунта де Галисия, А-Корунья, Испания, было сохранение и характеристика галисийских филогенетических образцов. Это побудило CIAM искать эти экотипы и собирать образцы хлебной пшеницы в сообществе Галисия, в основном с 2002 по 2014 год [18].

Эти местные популяции хлебной пшеницы хранятся в банке гермоплазмы CIAM, который в настоящее время содержит 196 экотипов хлебной пшеницы. Половина образцов была охарактеризована с использованием агрономических дескрипторов и дескрипторов качества зерна [17]. Кроме того, все образцы были описаны по их высокомолекулярным глютениновым субъединицам [17]. За последние несколько лет в CIAM были отобраны различные линии из этих экотипов; пять из них были зарегистрированы как местные сорта ('Callobre', 'Caaveiro', 'Castrexo', 'Miño' и 'Arzua', с регистрационными номерами 20030328, 20130262, 20210292, 20210293 и 20210294, соответственно). Галисийская пшеница имеет высокое содержание белка и растяжимости, а содержание глютена подходит для галисийского хлеба, делая его более темным, с более интенсивным ароматом и вкусом [19]. Галисийская пшеница дает слабую или среднюю по силе муку, поэтому ее обычно смешивают с более сильной и эластичной мукой.

Предыдущие исследования продемонстрировали эффективность различных ПЦР-методов в прослеживаемости и обнаружении загрязнения в производстве пшеницы, включая: идентификацию и количественное определение семян пшеницы, толерантной к комарику (MTW), смешанных с восприимчивым к комарику сортом [20]; количественное определение уровня загрязнения в 3% в производственной цепи макаронных изделий [21]; обнаружение мягкой пшеницы в манной крупе и хлебе с порогами обнаружения 3% и 5% [22]; количественное определение генотипа в производстве макаронных изделий [23]; обеспечение исключительного использования твердой пшеницы в макаронах и традиционном хлебе [24,25]; и идентификацию сортов и обнаружение перекрестного загрязнения с пределом обнаружения 5% для конкретных сортов-загрязнителей [26]. В исследовании с использованием SSR Су и др. [27] обнаружили, что добровольная пшеница (падалица), «вид пшеницы с сорняковыми характеристиками, широко распространенный в основных пшеничных регионах Китая», проявляла большую изменчивость по сравнению с культивируемой пшеницей, причем две демонстрировали довольно отдаленные филогенетические отношения. Дальнейшие исследования оценивали генетическое разнообразие и структуру популяции пшеницы с использованием SSR [28,29,30,31,32,33,34,35,36] и межмикросателлитных повторов (ISSR) [32,37]. Предыдущие работы в CIAM позволили лучше изучить экотипы и зарегистрировать линии, отобранные в качестве местных сортов, что позволило использовать их как часть муки, необходимой для изготовления галисийского хлеба под защищенным географическим указанием (PGI) «Pan Gallego». 'Caaveiro' и 'Callobre' были ранее идентифицированы с помощью SSR [38] в комбинированной стратегии, которая включала питательный состав [39], микроскопию [40] и нейронные сети [41] для прослеживаемости галисийской пшеницы в галисийском хлебе от поля до стола. Однако существует 196 галисийских экотипов и местных сортов, сохраненных в CIAM, которые ранее не оценивались с помощью SSR и которые могут быть использованы для производства галисийского хлеба, защищенного PGI Pan Gallego. Предыдущая оценка с 17 SSR была успешной в идентификации 'Caaveiro' и 'Callobre' среди коммерческих сортов [38], даже в смешанной муке. Используя Xgwm0312 в ddPCR, был точно определен процент муки 'Caaveiro' в слепых смесях муки. Количественное определение с помощью ddPCR имеет тот же порядок, что и оценка с помощью микроскопии [40] и нейронных сетей [41], подтверждая уникальность галисийской пшеницы 'Caaveiro'. Поэтому необходимо расширить эту предыдущую работу на большое количество галисийских экотипов, сортов и элитных линий. Целью данного исследования была оценка генетического разнообразия и структуры галисийских экотипов и сортов пшеницы, определение их потенциального происхождения, дифференциация их от коммерческих сортов и исследование их полезности для прослеживаемости от поля (экотипы и сорта) до вилки (мука, закваска и хлеб) в рамках производственной цепи хлеба PGI «Галисийский хлеб».

2.1. Растительный материал

Всего было оценено 14 местных экотипов пшеницы, определенных как популяции фермеров Вилла и др. [42] (ID 1, 5, 8, 10, 11, 13, 16, 17, 19, 22, 24, 30, 41 и 43), 4 элитные линии (1910-4, 1967-5, E1L2 и E16L30) и 2 галисийских сорта ('Caaveiro' (пре-база) и 'Callobre' (база), оба зарегистрированные как коммерческие сорта (20130262 и 20030328)) (Таблица S1). Предыдущие инбредные линии 1967-5, E1L2 и E16L30 недавно были зарегистрированы как местные сорта (Arzua 20210294, Miño 20210293 и Castrexo 20210292, соответственно). Растения озимой пшеницы выращивались в 2021 году на экспериментальной ферме (43°14′36″ с.ш. –8°16′24″ з.д.) CIAM-AGACAL (Аграрный исследовательский центр Мабегондо, Ксиунта де Галисия, А-Корунья, Испания).

Это исследование включило следующие 14 коммерческих сортов, ранее оцененных Рамос Кабрер и др. [38]: 'Enebro'; 'Nogal'; 'Rebelde'; 'Ovalo'; 'Valbuena'; 'Montecarlo'; 'Algoritmo'; 'Basilio'; 'Tocayo'; 'Radia'; 'Atomo'; 'Sensas'; 'Acorazado'; и 'Alhambra'. В исследование также были включены следующие четыре галисийских образца для сравнения: 'Caaveiro'; 'Carral'; 'Trigo Pais'; и 'Callobre'.

Всего было протестировано 296 образцов ДНК растений, экстрагированных из листьев, в соответствии с методологией, описанной Рамос-Кабрер и др. [38]. Это включало 10 проростков от каждого из 14 экотипов (в результате 138 образцов, два из которых не были успешно амплифицированы); 100 проростков от 4 элитных линий (1910-4, 1967-5, E16L303 и E1L2); 20 образцов от каждого из 2 сортов (всего 40 образцов); и 1 образец от каждого из 14 коммерческих сортов и 4 галисийских образцов для сравнения (всего 18 образцов), которые не показали внутрисортовой изменчивости [38].

2.2. Пшеничная мука, закваска и хлеб

Для обеспечения прослеживаемости была проведена оценка 38 видов пшеничной муки, включая 23 коммерчески доступных сорта, 6 галисийского происхождения и смешанные муки (см. Таблицу S1). Дополнительно были оценены два образца закваски, один коммерчески доступный и другой галисийского происхождения. Кроме того, оценка включила 18 образцов хлеба, состоящих из 10 коммерческих хлебов, 3 галисийских хлебов и 5 хлебов, изготовленных из смешанной муки. Амплификация для всех SSR не могла быть получена для каждого образца хлеба.

2.3. Выделение ДНК и условия ПЦР

Экстракция ДНК. Экстракция ДНК проводилась с использованием 0.5–0.75 г молодых листьев с помощью набора E.Z.N.A.®Plant DNA Kit (OMEGA Bio-Tek Inc., Норкросс, Джорджия, США) и набора DNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen, Хильден, Германия). Экстрагированная геномная ДНК количественно определялась с помощью спектрофотометра NanodropTM ND-1000 (Thermo Scientific, Уилмингтон, Делавэр, США) и впоследствии разбавлялась до 20 нг/мкл. Те же наборы использовались для экстракции ДНК из муки и закваски. Однако для хлеба использовался Speedtools Food DNA Extraction Kit (Biotools B&M Labs., S.A., Мадрид, Испания).

Микросателлиты. Для этих анализов были отобраны 17 SSR, которые проявляли высокий полиморфизм в предыдущих исследованиях, проведенных в Испании [38,43] (Таблица 1). SSR амплифицировали в 5 мультиплексных ПЦР с использованием праймера, меченного флуорофором: FAM, NED, PET или VIC (PE Applied Biosystems, Уоррингтон, Великобритания).

Таблица 1. Аллели в п.н. для 17 микросателлитов (SSR) для 156 уникальных генотипов местных галисийских экотипов/сортов и коммерческих сортов пшеницы, а также 38 образцов муки, 2 заквасок и 18 образцов хлеба.

Условия ПЦР и детекция аллелей. Условия амплификации были следующими: 5 мин при 94 °C, затем 35 циклов по 30 с при 95 °C, 90 с при температуре отжига, специфичной для мультиплексного набора, и 1 мин при 72 °C, и конечное удлинение в течение 30 мин при 60 °C.

Затем амплифицированные продукты разбавляли водой. Объем 2 мкл разбавленного продукта амплификации добавляли к 0.12 мкл стандарта размера 600LIZ (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) и 9.88 мкл формамида. Размеры аллелей определялись с помощью программного обеспечения Peak Scanner™ v 1.0 (Applied Biosystems).

2.4. Анализ данных

Экотипы и сорта. Размер выборки, количество аллелей, количество эффективных аллелей, информационный индекс, наблюдаемая гетерозиготность, ожидаемая и несмещенная ожидаемая гетерозиготность и индекс фиксации были оценены с использованием GenAlEx 6.2 [44].

Рассматривая уникальные генотипы, байесовский анализ был проведен с использованием программного обеспечения Structure версии 2.3.4. [45,46]. Этот анализ использовал модель примеси с несвязанными локусами и коррелированными частотами аллелей, как описано в исследованиях Руис и др. [43], Перейра-Лоренсо и др. [47] и Поррас-Хуртадо и др. [48]. В последнем исследовании рекомендовалось минимум 20 итераций, хотя в данном конкретном исследовании использовалось 30 итераций для оценки пропорций принадлежности предков популяции. Программное обеспечение Structure использует оценку Марковской цепи Монте-Карло (MCMC), случайным образом назначая особей заранее определенному количеству групп. Частоты вариантов затем оцениваются для каждой группы, и особи переназначаются на основе этих оценок. Этот процесс повторяется много раз, часто до 200 000 итераций в процессе "прожига", за которым следуют 1 000 000 повторений MCMC (Монте-Карло Марковская цепь) [48,49,50], что приводит к надежным оценкам частот аллелей и вероятностей принадлежности для каждой популяции [48]. Мы вычислили значения K в диапазоне от 1 до 15 [46,47], представляющие неизвестные реконструированные панмиктические популяции (RPP) генотипов. Были выбраны опции popinfo = 0 и popflag = 0, предполагая, что sampled генотипы были неизвестного происхождения [47]. Эти генотипы были вероятностно assigned к RPP на основе вероятности принадлежности (qI) 80% [47,49,50]. Генотипы с более низкой вероятностью считались смешанными. Также был рассчитан критерий ΔK (вторая производная логарифма правдоподобия, деленная на стандартное отклонение правдоподобия), чтобы определить лучшее значение K, поддерживаемое данными [51]. Этот расчет был выполнен с использованием Structure Harvester 8.

GenAlEx 6.2 [44] был использован для проведения анализа молекулярной дисперсии (AMOVA) [52,53] с учетом RPP, полученных с помощью программного обеспечения Structure.

Для уникальных генотипов экотипов и сортов, программное обеспечение DARwin, версия 6.0.010, было использовано для построения дерева несходства [54,55,56] с использованием опции "Dissimilarity for Allelic data", с последующим невзвешенным присоединением соседей для построения дерева со всеми генотипами.

Факторный анализ соответствий (FCA) был выполнен с использованием метода главных компонент (PC) в SPSS Версия 28 [57]. Для каждого уникального генотипа экотипов (до 20 образцов) и коммерческих сортов (до 10 образцов) частота каждого аллеля была assigned переменной, со значениями 1 и 0, указывающими на наличие и отсутствие аллеля, соответственно. PC были оценены на основе матрицы дисперсии-ковариации частот аллелей [58,59,60] с использованием программного обеспечения SPSS (версия 28) [57].

Графические представления PC включали генетическую структуру и тип материала, оцененного с помощью SSR.

Мука, закваска и хлеб. Чтобы оценить использование 17 SSR в прослеживаемости от земли (экотипы и сорта) до стола (мука, закваска и хлеб) в производстве галисийского хлеба (PGI), был выполнен второй FCA с использованием метода PC в SPSS V.28 [57], включив уникальные генотипы, полученные для 38 образцов муки, 2 заквасок и 18 образцов хлеба, в предыдущий FCA. Частота каждого аллеля снова была assigned переменной, со значениями 1 и 0, указывающими на наличие и отсутствие аллеля, соответственно.

3.1. Генетическое разнообразие

В этом исследовании было идентифицировано 156 уникальных генотипов (Таблица S1) из общего количества 296 образцов ДНК растений. Среди них 13 были коммерческими сортами ('Alambra' и 'Sensas' показали одинаковый генотип), а остальные 143 были местными сортами ('Caaveiro' и 'Carral' имели одинаковый генотип) и экотипами.

'Caaveiro' и 'Caaveiro' (пре-база) (семена, используемые для целей сертификации), 'Callobre' и 'Callobre' (пре-база), E16L30 (сорт 'Castrexo') и 1910-4 каждый представили уникальный генотип. Однако элитные линии E1L2 (сорт 'Miño') и 1967-5 (сорт 'Arzua') показали вариации для 7 и 1 SSR соответственно. Один образец, ошибочно классифицированный как 'Caaveiro' (пре-база), оказался 'Callobre'; однако он показал аллели 'Caaveiro' для 2 из 17 SSR.

Все экотипы показали более одного генетического профиля, причем популяции 8, 11 и 22 имели наименьшее количество генотипов (8), а 1, 5, 10, 16, 17, 19, 24 и 30 — наибольшее (10); следовательно, клональность варьировала от 0 до 20%, в среднем 6.4%.

В этом исследовании было идентифицировано 221 аллелей. Из них 151 был найден у местных сортов и экотипов, а 134 присутствовали у коммерческих сортов. В частности, 65 аллелей были эксклюзивными для местных сортов и экотипов, а 50 были уникальными для коммерческих сортов. Дополнительно, 69 были классифицированы как редкие аллели у местных сортов и экотипов, и 37 были редкими у коммерческих сортов (Таблица 1 и Таблица S2).

Среднее количество аллелей на локус составило 11. Локус Xgwm0312 показал самый высокий уровень полиморфизма с 27 аллелями, в то время как BARC80 имел самый низкий, с 6 аллелями.

Образцы муки, закваски и хлеба в совокупности представили 149 аллелей (Таблица 1 и Таблица S2). Из этих аллелей восемь ранее не сообщались в исследованиях (четыре в коммерческой муке, два в галисийском хлебе и два в обоих). Кроме того, 14 эксклюзивных аллелей для местных экотипов и сортов присутствовали в образцах муки, закваски и хлеба.

Средняя наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготности составили 0.23 и 0.68 соответственно. Минимальная наблюдаемая гетерозиготность (Ho) 0 была найдена для Xgwm0332-B и Xgwm0513-B, а максимум 1 наблюдался для Xgwm0234. Минимальная ожидаемая гетерозиготность (He) 0.38 была отмечена для Xgwm0148, а максимальная He 0.91 была зарегистрирована для Xgwm0312 (Таблица S2).

3.2. Генетическая структура, несходство аллельных данных и факторный анализ соответствий

Генетическая структура. Байесовский анализ был проведен с использованием программного обеспечения Structure [45]. Этот анализ использовал 17 SSR для определения генетической структуры среди 156 уникальных генотипов. Согласно критерию ΔK, наиболее вероятная оценка была K = 2 (Рисунок S1 и Таблица S1). Эта оценка была получена с использованием Structure Harvester [61] и применена к группе из 155 генотипов из общего числа 156, каждый с qI > 80% (представляющих 99% всех генотипов). Этот анализ привел к сильной дифференциации на две основные группы генотипов, также известные как RPP. Первая группа, RPP1, состояла из 31 генотипа, что составляло 19.87% от общего числа генотипов. Эта группа включала коммерческие сорта и две популяции (41 и 43) из Фольгосо-до-Каурель, Луго. Вторая группа, RPP2, состояла из 125 генотипов, представляющих 80.13% от общего числа генотипов. Дополнительный генотип с qI > 70% также считался частью этой группы. RPP2 исключительно включала местные сорта, элитные линии и экотипы (Рисунок 1 и Таблица S1).

Рисунок 1. Байесовский анализ, проведенный с использованием 17 микросателлитов (SSR) с программным обеспечением Structure на 156 уникальных генотипах, включая местные галисийские экотипы/сорта и коммерческие сорта пшеницы, а также 38 образцов муки, 2 закваски и 18 образцов хлеба. Генетическая структура была проанализирована для K = 2 с коммерческими сортами (RPP1 красным), и для K = 2, 3 и 6 для местных галисийских сортов и экотипов, исключая коммерческие сорта из анализа.

Генетическая дифференциация между RPP1 (которая включала коммерческие сорта и 2 экотипа, 41 и 43) и RPP2 (включающая местные сорта, элитные линии и экотипы) была значительно высокой, со значением Fst 0.260 (p < 0.01).

Дифференциация между коммерческими и местными сортами была обусловлена специфическими аллелями, присутствующими в каждой группе (50 и 65 соответственно). Большее количество этих специфических аллелей у местных сортов было найдено в SSR Xgwm0312, Xgwm0332 и Xgwm0577 (Таблица 1). Общее количество аллелей также было выше у местных сортов: 151 по сравнению с 134 у коммерческих сортов. Эта тенденция также наблюдалась в количестве эффективных аллелей (Таблица S2).

He была значительно выше (0.629 и 0.599 для RPP1 и RPP2 соответственно), чем Ho (0.215 и 0.233 для RPP1 и RPP2 соответственно).

Второй байесовский анализ был проведен на RPP2, который состоял из 125 местных генотипов. Этот анализ исключил коммерческие сорта и связанные галисийские популяции из RPP1. Анализ выявил, что наиболее вероятными подразделениями являются K = 2, 3 и 6 подгрупп (Рисунок 1). Для K = 2, сорта 'Caaveiro', 'Callobre', 'E1L2' и 1967-5 и большинство галисийских популяций были сгруппированы в RPP2a. Эта группировка дифференцировала популяции 22 и 24 в RPP2b. K = 3 сгруппировал большинство образцов популяций 8, 10 и 17 в RPP3c. K = 6 дифференцировал 'Caaveiro' (сгруппированный в RPP6d) от 'Callobre' (сгруппированный в RPP6a). Дополнительно были сформированы еще две группы: одна, включающая галисийские популяции 11 и 1967-5 (сгруппированные в RPP6e), и другая с популяциями 13 и 30 (сгруппированные в RPP6f).

Несходство аллельных данных. Дерево присоединения соседей (NJ), основанное на матрице генетических расстояний 156 генотипов пшеницы, также сгруппировало эти генотипы в соответствии со структурой для K = 2 (Рисунок 2). Эта группировка включала коммерческие сорта и экотипы 41 и 43 из Луго в отдельную ветвь, но они не были смешаны. Элитная линия 'E1L2' была генетически ближе к сорту 'Callobre'. Это можно объяснить их общим происхождением от исходного экотипа 'Callobre', из которого обе были отобраны в А-Корунье. Напротив, элитная линия 'E16L30' и 'Caaveiro', которые также произошли от экотипа 'Callobre', были более удалены. Это также относилось к элитной линии из Луго, '1910-4'.

Рисунок 2. Дерево присоединения соседей, построенное с использованием 17 SSR для 156 уникальных генотипов пшеницы. Коммерческие сорта и галисийские экотипы, ассоциированные с RPP1 (K = 2), идентифицированные с помощью программного обеспечения Structure, выделены красным. Зеленым цветом показаны местные экотипы и сорта.

FCA. Когда был выполнен факторный анализ соответствий (FCA) с использованием метода PC, PC1 и PC2 accounted для 21% общей вариации, подтверждая значительную дифференциацию между местными сортами и галисийскими популяциями от коммерческих сортов в первом PC. Подструктура (K3 в RPP2) в основном наблюдалась во втором PC (Рисунок 3). Всего 63 эксклюзивных аллеля дискриминировали местные экотипы и сорта в отрицательном PC1, среди которых два имели более сильное влияние (Таблица 1 и Таблица S1), а именно: 153 для WMC468; и 132 для Xgwm0060. Пятьдесят эксклюзивных аллелей для коммерческих сортов оказали положительное влияние на PC1, включая: 160 для Xgwm0513A; 283 для Xgwm0156; 203 для Xgwm0513B; 148 для WMC468; 250 для Xgwm0332B; 192 для Xgwm0312; 147 для Xgwm0088; и 196 для Xgwm0312.

Рисунок 3. Факторный анализ соответствий (FCA) был проведен с использованием метода главных компонент в SPSS V.22 для изучения вариации аллелей по 17 SSR для набора из 156 генотипов. Генотипы были коммерческими сортами и галисийскими экотипами 41 и 43, которые были ассоциированы с RPP1 для K = 2 и были получены с помощью программного обеспечения Structure вместе с коммерческими сортами. Кроме того, три подгруппы для K = 3 местных сортов и галисийских экотипов (RPP3 a, b и c) также были включены в анализ.

Это исследование выявило множественные генотипы для каждого экотипа (Таблица S1), которые были связаны с их географическим происхождением на уровне провинции (показано только для PC1, Рисунок 4). Эта генетическая вариация была особенно очевидна для популяций 41 и 43, классифицированных в RPP1 для K = 2, когда коммерческие сорта были включены в анализ (Рисунок 1 и Рисунок 2), и которые были собраны в Луго. Эта провинция показала самую высокую генетическую изменчивость в исследовании, поскольку она также была источником экотипов, классифицированных в RPP3a, b и c. Напротив, провинции Понтеведра и Оренсе показали самые низкие генетические вариации, причем первая была источником одного экотипа, сгруппированного в RPP3a, а вторая группировала один генотип в RPP3c. Это также было связано с меньшим количеством записей из этих провинций в этом исследовании. Более того, PC1 (Рисунок 4) также показывает, насколько эти экотипы генетически разнообразны. Например, генотипы из экотипа 11, классифицированные в RPP3a, были отделены от тех, которые считались смешанными. Кроме того, генотипы из экотипов 41 и 43 (сгруппированные в RPP1) были перемешаны в PC1, что указывает на трудность их дифференциации. Мы представили галисийские местные сорта и элитные линии с коммерческими сортами, чтобы показать не только значительную генетическую дифференциацию 'Caaveiro' и 'Caaveiro' (пре-база) (семена, используемые для целей сертификации), 'Callobre' и 'Callobre' (пре-база), E16L30 (сорт 'Castrexo') и 1910-4, но также вариацию, найденную для элитных линий E1L2 (сорт 'Miño') и 1967-5 (сорт 'Arzua'). Тот же ошибочно классифицированный как 'Caaveiro' (пре-база) разместился между 'Caaveiro' и 'Callobre' для PC1, потому что он показал генетический профиль 'Callobre' с аллелями 'Caaveiro'.

Рисунок 4. Факторный анализ соответствий (FCA) был проведен с использованием метода главных компонент в программном обеспечении SPSS V.22 для изучения вариации аллелей по 17 SSR для коллекции из 156 генотипов. Распределение генотипов, категоризированных по провинции (PROV), с учетом PC1 и RPP1 (включая коммерческие сорта и связанные галисийские экотипы) для K = 2, полученных с использованием программного обеспечения Structure. Дополнительно, три подгруппы галисийских местных сортов и экотипов, идентифицированные для K = 3, обозначены как RPP3a, RPP3b и RPP3c.

Большинство образцов каждого экотипа были assigned к определенному RPP; однако некоторые образцы были классифицированы как смешанные. Например, популяции 11 и 19 были из Понтеведры и Оренсе, соответственно (Рисунок 4 и Таблица S1). Ни один образец из какой-либо другой галисийской популяции, кроме 41 и 43, не был классифицирован с коммерческими сортами (RPP1 для K = 2). Однако, когда коммерческие сорта были исключены, некоторые образцы были классифицированы в другие RPP, чем большинство. Например, для K = 2, галисийская популяция 1 показала семь генотипов в RPP2b, один в RPP2a и один был смешанным. Аналогично, популяция 8 представила семь генотипов в RPP2b и один в RPP2a (Таблица S1).

3.3. Прослеживаемость галисийской пшеницы в образцах муки, закваски и хлеба

Оцененные в этом исследовании SSR смогли идентифицировать галисийские экотипы и сорта, а также их использование в производстве муки, заквасок и хлебов, предписанных PGI "Галисийский хлеб" [19]. Всего 14 эксклюзивных аллелей местных экотипов и сортов присутствовали в образцах муки, закваски и хлеба (Таблица 1 и Таблица S1), что позволяет отслеживать использование местных пшениц. Семнадцать SSR показали эксклюзивные аллели для коммерческих сортов, в то время как шестнадцать SSR (все, кроме Xgwm0002) показали эксклюзивные аллели как для местных сортов, так и для экотипов. SSR Xgwm0513 имел наибольшее количество эксклюзивных аллелей для коммерческих сортов — восемь эксклюзивных аллелей, тогда как Xgwm0234 и BARC80 имели только по одному эксклюзивному аллелю. Что касается местных сортов и экотипов, SSR Xgwm0312 представил наибольшее количество эксклюзивных аллелей — 16, в то время как Xgwm0088 имел наименьшее — всего 1 эксклюзивный аллель.

Когда FCA с использованием метода PC был выполнен с включением экотипов, коммерческих и местных сортов, а также образцов муки, закваски и хлеба, первые три PC accounted для 33% дисперсии (Рисунок 5). Местные экотипы из CIAM были четко дифференцированы на отрицательной стороне PC1 от коммерческих сортов, что было обусловлено специфическими аллелями, идентифицированными в этом исследовании (Таблица 1, Таблицы S1 и S3), specifically эксклюзивными аллелями для экотипов и сортов, в основном 153 для WMC468 и 101 для BARC80, среди других (55) с отрицательным влиянием на PC2. Однако экотипы 41 и 43 были исключениями, так как они группировались ближе к коммерческим сортам на отрицательной стороне PC2, тем самым подтверждая результаты, представленные в дереве присоединения соседей (Рисунок 2). Пятьдесят эксклюзивных аллелей для коммерческих сортов и еще 14, найденных в коммерческих муках, заквасках и хлебах, оказали влияние на положительный PC1, particularly 118 для Xgwm0060, 146 для WMC468, 127 для Xgwm0186 и 208 для Xgwm0332B.

Рисунок 5. Факторный анализ соответствий (FCA) был проведен с использованием метода главных компонент в программном обеспечении SPSS V.22 для изучения вариации аллелей по 17 SSR для коллекции из 156 генотипов (коммерческие и местные сорта и экотипы), 38 муок, 2 заквасок и 18 хлебов.

Мука и хлеб, произведенные с коммерческими сортами, были сгруппированы вместе. Мука и хлеб, изготовленные из смеси галисийской пшеницы, были сгруппированы между галисийской группой и коммерческими сортами на положительных сторонах осей PC1 и PC2 (Рисунок 5). Единственными исключениями из этого были мука, закваска и хлеб, изготовленные исключительно из галисийской пшеницы, которые были сгруппированы с галисийской группой (отрицательный PC1 и положительный PC2).

23 проанализированные коммерческие муки показали эксклюзивные аллели, как и ожидалось (Таблица 1 и Таблица S1). Три проанализированные галисийские муки показали эксклюзивные аллели от местных экотипов и сортов; однако, три приобретенные галисийские муки представили только эксклюзивные аллели коммерческих пшениц (Таблица S1). Коммерческая закваска представила эксклюзивные аллели коммерческих сортов, как и ожидалось, но та, что была сделана из муки 'Caaveiro', имела галисийские и коммерческие эксклюзивные аллели.

После анализа 11 хлебов из пекарен, только 7 представили эксклюзивные аллели коммерческих сортов, только 1 имел эксклюзивные аллели местных экотипов и сортов, и 3 показали аллели как от коммерческих, так и от местных экотипов и сортов (Таблица 1 и Таблица S1). Хлеб из пекарни "Doval" амплифицировал только для Xgwm0186, амплифицируя два эксклюзивных аллеля коммерческих сортов и аллель 119, который присутствует в пшенице 'Caaveiro', что указывает на то, что в пекарне использовалась смешанная мука. Один из трех хлебов, изготовленных из галисийской муки, представил эксклюзивные коммерческие аллели, что предполагает загрязнение в процессе выпечки. Наконец, хлебы, приготовленные из смешанной муки, представили эксклюзивные аллели как от местных, так и от коммерческих экотипов и сортов.

4.1. Генетическое разнообразие

Микросателлиты, выбранные для этого исследования, проявили полиморфизм и продемонстрировали выраженную генетическую дивергенцию между коммерческими сортами и галисийскими популяциями и сортами. Эта дивергенция ранее облегчала отслеживание использования галисийской муки в смесях галисийского хлеба [38]. Более того, это подтвердило способность SSR дифференцировать галисийские пшеницы, когда исследование включало большее количество экотипов и сортов. Следовательно, это облегчило отслеживание этих пшениц в смешанных смесях с коммерческими сортами.

Наблюдение более низкой Ho по сравнению с He по всем локусам согласуется с инбриндинговыми признаками твердой пшеницы, происходящей из Эфиопии [29]. Предыдущие исследования сообщали о большем генетическом разнообразии у твердой пшеницы по сравнению с хлебной пшеницей в местных сортах из различных стран, включая Оман [62] и Испанию [1].

4.2. Генетическая структура, несходство аллельных данных и факторный анализ соответствий

Генетическая дифференциация между галисийскими популяциями (RPP2) и коммерческими сортами (RRP1), как указано значением Fst, превышающим 0.26, подразумевает значительную дифференциацию между двумя группами. Этот уровень дифференциации вполне сравним с наблюдаемым в исследовании с однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) сортов хлебной пшеницы INIA–Уругвай [63]. Более того, он превосходит значения генетической дифференциации, полученные с помощью AMOVA среди популяций твердой пшеницы из Эфиопии (12%) [29]. Эта дифференциация также значительно выше, чем сообщалось в различных исследованиях, включая: Мондини и др. [64] в твердой пшенице (18.76%); Алипур и др. [65] в иранской гексаплоидной пшенице (15.56%); Амалла и др. [66] в твердой пшенице Средиземноморского региона (16%); Арора и др. [67] в индийских сортах пшеницы (21.29%); и Руис и др. [43] в испанской тетраплоидной пшенице (20%).

По-видимому, существует distinct генетический пул, репрезентативный для большинства экотипов галисийской хлебной пшеницы, в отличие от большинства других образцов с Иберийского полуострова. Это подтверждает результаты Паскуаля и др. [1] с использованием SNP и маркеров технологии Diversity Array Technology (DArT), которые идентифицировали генетически отдаленную группу западных иберийских пшениц. Это наблюдение согласуется с выводами Уркихо Заморы [17] в более ранних исследованиях, которые были основаны на профиле высокомолекулярных глютениновых субъединиц эндосперма. Паскуаль и др. [1] обнаружили, что группа, наиболее удаленная от набора референсных сортов, была западной группой, которая в основном состояла из галисийских образцов и образцов из Эстремадуры.

Образцы, происходящие из одной и той же популяции, классифицированные в разных RPP, указывали на высокую вероятность загрязнения. Это могло быть связано с естественной гибридизацией, происходящей на полях размножения. Альтернативно, это могло быть связано с менее строгим отбором семян [68], цитируя описание Брауна [69], которое охарактеризовало «местные сорта как географически или экологически distinctive популяции, которые проявляют заметное разнообразие в своем генетическом составе, как межпопуляционное [т.е. между местными сортами], так и внутрипопуляционное». Такое явление могло потенциально происходить внутри галисийских популяций, из которых были отобраны галисийские коммерческие сорта 'Caaveiro' и 'Callobre' (классифицированные как RPP2a программным обеспечением Structure).

Оцененные в этом исследовании галисийские экотипы не обладали местными названиями и не могли быть связаны с теми, которые задокументированы Гадеа [14] и Санчес-Монхе [15]. Следовательно, их не следует классифицировать как местные сорта в соответствии с определением, данным Вилла и др. [42]. Это определение постулирует, что «популяция фермера может составлять экотип, а совокупность экотипов, культивируемых в specific регионе (таком как деревня), обладающая local названием, будет классифицирована как местный сорт» (Chorlton, личное сообщение). Однако эти экотипы соответствуют концепции местного сорта, предложенной Вилла и др. [42], которая не включает local название в определение, предложенное следующим образом: «Местный сорт — это dynamic популяция(и) культивируемого растения, которая имеет historical происхождение, distinct идентичность и lacks формального улучшения сортов, в то время как часто является генетически разнообразной, locally адаптированной и ассоциированной с traditional системами земледелия».

В контексте местных сортов пшеницы наблюдалась considerable степень генетического разнообразия среди образцов, собранных в различные временные рамки, географические регионы и климатические зоны. Следовательно, генетическая изменчивость, присущая этим местным сортам, может быть influenced множеством факторов. К ним относятся specific годы сбора, антропогенное воздействие, оказываемое через dynamic практики хранения, range потребностей и конечного использования, обмен семенами (который облегчает поток генов) между фермерами, а также географические и environmental условия, преобладающие в регионах, где пшеница культивируется [65].

В рамках нашего исследования ряд экотипов evolved в сорта, такие как зарегистрированные коммерческие сорта 'Caaveiro', 'Callobre' и 'Castrexo' (E16L30), а также элитная линия (1910-4). Каждый из этих местных сортов exhibited уникальный генотип после отбора. Однако элитные линии E1L2 (зарегистрированный как сорт 'Miño') и 1967-5 (зарегистрированный как сорт 'Arzua') demonstrated вариацию для семи и одного SSR соответственно. Несмотря на эту изменчивость, стабильность агроморфологических характеристик была consistent с требованиями регистрации.

Анализы Structure и NJ дерева с 156 генотипами пшеницы revealed, что 2 экотипа из Луго (41 и 43) были сгруппированы, хотя и не смешаны, с коммерческими сортами. Это suggests большую генетическую proximity к этим сортам по сравнению с другими экотипами и местными сортами, которые были единственными, которые приближались к высоте коммерческих сортов (Urquijo, личное сообщение). Экотипы 41 и 43 имеют similar высоту и дату цветения другим экотипам, собранным в близлежащих районах Луго, таким как экотипы 97 и 57 (Фольгосо-до-Каурель), 110 (Ас-Ногаис) и 146 (Монфорте-де-Лемос), которые тестировались с 2012 по 2014 год [17]. Однако они не были включены в это исследование с использованием SSR.

Галисийские экотипы 41 и 43 align с объяснением, предоставленным Вилла и др. [42], относительно belief, что «местные сорта могут even быть отобраны из сортов». Термины such как 'креолизация' и 'рустикация' employed в этом контексте. Как Зевен [70] elucidated, «в отсутствие традиционной и формальной селекции по поддержанию, любой улучшенный местный сорт (сорт), включая гибридный сорт, будет regress со временем в местный сорт». Более того, согласно личному сообщению Эмброуза, «сорт, который рос под low давлением отбора по specific признакам, но не по uniformности, в течение long времени, мог бы считаться местным сортом». В северо-западном регионе Испании коммерческие сорта пшеницы predominantly культивировались с 1980-х годов. Они могли пройти ancient процесс рустикации из-за заброшенности сельских районов или перехода культур на пастбища и леса, particularly в изолированных долинах, such как О-Каурель, который является источником экотипов 41 и 43. Наоборот, plausible, что эти экотипы, по сравнению с остальными галисийскими экотипами пшеницы, были introduced из другого испанского региона, mirroring происхождение коммерческих сортов.

4.3. Прослеживаемость галисийской пшеницы в образцах муки, закваски и хлеба

Прослеживаемость constitutes главную проблему в сфере quality брендов, particularly в PGI, such как 'Галисийский Хлеб'. Молекулярные маркеры proven быть robust инструментами в отслеживании пути галисийской пшеницы от поля до стола, predominantly в случае муки и заквасок, и aligned с другими techniques, such как микроскопия и нейронные сети [40,41]. Однако их efficacy somewhat уменьшена в хлебе due to фрагментации ДНК во процессе выпечки [71]. Наше исследование affirmed полезность набора из 17 SSR в отслеживании происхождения галисийской пшеницы. Этот набор demonstrated ранее positive результаты с 'Caaveiro' [38] и был applied в этом исследовании к comprehensive образцу галисийской пшеницы, муки, закваски и хлеба. В 58 образцах муки, заквасок и хлебов, проанализированных в этом исследовании, 27.6% были found быть неправильно маркированы. Этот finding подчеркивает efficacy этого набора SSR в идентификации мошенничества или загрязнения во процессе выпечки.

Некоторые другие исследования addressed прослеживаемость specific пшениц в смесях семян и transformed продуктах, such как манная крупа, хлеб и макаронные изделия. Предыдущее исследование прослеживаемости с ddPCR идентифицировало и количественно определяло семена MTW, смешанные с восприимчивым к комарику сортом в соотношении 9:1 [20]. В отдельном исследовании Морсия и др. [21] employed cdPCR assay для accurate количественного определения уровня загрязнения пшеницы в 3% within цепи производства макаронных изделий, encompassing этапы от сырья до конечных продуктов, derived из твердой пшеницы (Triticum durum). SSR были used для обнаружения мягкой пшеницы в манной крупе и хлебе с использованием qualitative ПЦР [22], с порогами обнаружения 3 и 5% соответственно, что позже было reduced до 2.5% через application ПЦР в реальном времени для monitoring производства хлеба Альтамура, знака Европейского Защищенного Наименования Происхождения (PDO). Позже, Морсия и др. [21] used успешную цифровую ПЦР для количественного определения генотипа в цепи производства макаронных изделий. Соннанте и др. [24] и Карлони и др. [25] used ПЦР в реальном времени для оценки exclusive использования твердой пшеницы в макаронах и традиционных хлебах из твердой пшеницы.

Подобно нашему исследованию, Фанелли и др. [26] evaluated SSR для идентификации сортов твердой пшеницы в производстве манной крупы и коммерческих макаронных изделий, отслеживая использование сортов, declared производителем, в comparison с другими сортами твердой пшеницы, commonly used в производстве макаронных изделий. Они found иностранные аллели, suggesting потенциальное перекрестное загрязнение. Более того, они assessed точность смеси, с пределом обнаружения 5% (в/в).

Молекулярные маркеры были instrumental в идентификации перекрестного опыления within экотипов, сохраненных в CIAM, facilitating их гомогенизацию для сертификации местных сортов. Эти маркеры также confirmed их полезность в отслеживании генотипов и их производных продуктов, particularly местной муки, used в производстве высококачественного галисийского хлеба. В этом исследовании мы идентифицировали уровень ошибочной классификации 27.6% среди проанализированных образцов муки, заквасок и хлебов. Галисийская пшеница exhibited большее разнообразие по сравнению с тестируемыми современными сортами, представляя distinct генный пул, crucial для поддержания качества галисийского хлеба в селекционных программах. Специфические аллели галисийской пшеницы enable эффективную прослеживаемость в производстве галисийского хлеба под обозначением PGI, particularly в муке и закваске. Однако его application в выпеченных хлебах limited due to трудности получения ПЦР продуктов амплификации после выпечки.

Этот молекулярный подход enhances гарантии подлинности знака PGI European и contributes к улучшенным стратегиям сохранения для местной коллекции пшеницы, хранящейся в банке гермоплазмы CIAM-AGACAL. Эти findings подчеркивают важность сохранения и использования генетических ресурсов галисийской пшеницы для поддержания unique характеристик традиционного галисийского хлеба.

В качестве практического вывода, мы developed базу данных, employing 17 SSR для отслеживания использования галисийской пшеницы от фермы до стола, ensuring подлинность PGI "Галисийский хлеб".

Следующая вспомогательная информация может быть загружена по адресу: https://www.mdpi.com/article/10.3390/agriculture15010051/s1, Рисунок S1: Delta K, полученный в результате байесовского анализа с программным обеспечением Structure [45] на 17 SSR, applied к экотипам и сортам пшеницы (a) и экотипам и сортам пшеницы, исключая коммерческие сорта (b); Таблица S1: Образцы, классифицированные в соответствии с реконструированной популяцией, resulting из байесовского анализа с использованием программного обеспечения Structure [45] на 17 SSR, applied к экотипам и сортам пшеницы, и к экотипам и сортам пшеницы, исключая коммерческие сорта; Таблица S2: Коммерческие сорта и местные экотипы и сорта пшеницы, оцененные с 17 SSR. Размер выборки, Кол-во Аллелей, Кол-во Эффективных Аллелей, Информационный Индекс, Наблюдаемая Гетерозиготность, Ожидаемая и Несмещенная Ожидаемая Гетерозиготность и Индекс Фиксации; Таблица S3: Эксклюзивные аллели для коммерческих сортов и для местных сортов и экотипов. Факторный анализ соответствий (FCA) был выполнен с использованием метода главных компонент (PC) в SPSS V.28.

References

1.    Pascual, L.; Ruiz, M.; López-Fernández, M.; Pérez-Peña, H.; Benavente, E.; Vázquez, J.F.; Sansaloni, C.; Giraldo, P. Genomic Analysis of Spanish Wheat Landraces Reveals Their Variability and Potential for Breeding. BMC Genom. 2020, 21, 122. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

2.    Marín-Sanz, M.; Sánchez-León, S.; León, E.; Barro, F. Comparative Characterization of the Gluten and Fructan Contents of Breads from Industrial and Artisan Bakeries: A Study of Food Products in the Spanish Market. Food Nutr. Res. 2022, 66, 8472. [Google Scholar] [CrossRef]

3.    Abdurezake, M.; Bekeko, Z.; Mohammed, A. Genetic Variability and Path Coefficient Analysis among Bread Wheat (Triticum Aestivum L.) Genotypes for Yield and Yield-related Traits in Bale Highlands, Southeastern Ethiopia. Agrosyst. Geosci. Environ. 2024, 7, 20515. [Google Scholar] [CrossRef]

4.    Hunter, M.C.; Smith, R.G.; Schipanski, M.E.; Atwood, L.W.; Mortensen, D.A. Agriculture in 2050: Recalibrating Targets for Sustainable Intensification. Bioscience 2017, 67, 386–391. [Google Scholar] [CrossRef]

5.    Patpour, M.; Hovmøller, M.S.; Justesen, A.F.; Newcomb, M.; Olivera, P.; Jin, Y.; Szabo, L.J.; Hodson, D.; Shahin, A.A.; Wanyera, R.; et al. Emergence of Virulence to SrTmp in the Ug99 Race Group of Wheat Stem Rust, Puccinia Graminis f. Sp. Tritici in Africa. Plant Dis. 2016, 100, 522. [Google Scholar] [CrossRef]

6.    Gadea, M. Los Trigos Españoles. Agric. Rev. Agropecu. 1949, 197–203. [Google Scholar]

7.    Gómez-Ibarlucea, C. Los Cereales de Invierno En Galicia. I: Situación Actual y Perspectivas. Agricultura 1989, 685, 720–723. [Google Scholar]

8.    Anuario de Estadística Agraria; MAPA (Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación): Madrid, Spain, 2024.

9.    Ramil Rego, P. Paleothnobotánica de Yacimientos Arqueológicos Holocenos de Galicia (No Cantábrico). Munibe Antropol. Arkeol. 1993, 45, 165–174. [Google Scholar]

10. Álvarez Núñez, A.; Ramil Rego, P.; Aira Rodríguez, M.J. Estudio Paleocarpológico Realizado En El Castro de Penalba (Campolameiro, Pontevedra. España). Bot. Complut. 1990, 16, 81–90. [Google Scholar]

11. Téllez Molina, R.; Alonso Peña, M. Los Trigos de la Ceres Hispánica de Lagasca y Clemente; Instituto Nacional de Investigaciones Agronomicas: Madrid, Spain, 1952. [Google Scholar]

12. Planellas Giralt, J. Ensayo de Una Flora Fanerogámica Gallega; Imprenta y litografía de D. Juan Rey Romero: Santiago, Spain, 1852. [Google Scholar]

13. Merino Román, B. Flora Descriptiva e Ilustrada de Galicia; Merino Román, B., Ed.; Tipografía Galaica: Santiago, Spain, 1909; Volume 3. [Google Scholar]

14. Gadea, M. Trigos Españoles; Instituto Nacional de Investigaciones Agronómicas: Madrid, Spain, 1954. [Google Scholar]

15. Sánchez-Monge, E. Catálogo Genético de Trigos Españoles; Ministerio de Agricultura: Madrid, Spain, 1957. [Google Scholar]

16. Sahuquillo, E.; Vila, M.I.F. Trigos de Cultivo Tradicional En Galicia: Caracterización Botánica e Agronómica; Xunta de Galicia: Santiago de Compostela, Spain, 1991. [Google Scholar]

17. Zamora, L.U. Estudio Agromorfológico y Caracterización de Las Gluteninas de Alto Peso Molecular de Los Ecotipos Autóctonos Gallegos de Triticum aestivum l. 1. Ph.D. Thesis, Universidad de Santiago de Compostela, Galicia, Spain, 2021. [Google Scholar]

18. Urquijo, L. ¿Cómo Recuperar Los Ecotipos Autóctonos? In Respostas Ás Preguntas Sobre o Pan e o Cereal do País, Serie Recursos Alimentarios 1; Romero Rodriguez, M., Pereira Lorenzo, S., Eds.; Monografías do Ibader: Lugo, Spain, 2018; pp. 33–38. [Google Scholar]

19. European Commission Regulation 2019/2182 of 16 December 2019 Entering a Name in the Register of Protected Designations of Origin and Protected Geographical Indications [Pan Galego (PGI)]. Off. J. Eur. Union 2019, 62, L330.

20. Perry, D.J.; Lee, S.J. Droplet Digital PCR for Verification of Interspersed Refuge in Midge Tolerant Wheat Varietal Blends. Can. J. Plant Sci. 2017, 97, 257–265. Available online: https://cdnsciencepub.com/doi/full/10.1139/cjps-2016-0223#.WlMAnv5Dsb0 (accessed on 10 December 2024).

21. Morcia, C.; Bergami, R.; Scaramagli, S.; Ghizzoni, R.; Carnevali, P.; Terzi, V. A Chip Digital PCR Assay for Quantification of Common Wheat Contamination in Pasta Production Chain. Foods 2020, 9, 911. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

22. Pasqualone, A.; Montemurro, C.; Grinn-Gofron, A.; Sonnante, G.; Blanco, A. Detection of Soft Wheat in Semolina and Durum Wheat Bread by Analysis of DNA Microsatellites. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 3312–3318. [Google Scholar] [CrossRef]

23. Morcia, C.; Terzi, V.; Ghizzoni, R.; Vaiuso, C.; Delogu, C.; Andreani, L.; Venturini, A.; Carnevali, P.; Pompa, P.P.; Tumino, G. Digital PCR for Genotype Quantification: A Case Study in a Pasta Production Chain. Biology 2021, 10, 419. [Google Scholar] [CrossRef]

24. Sonnante, G.; Montemurro, C.; Morgese, A.; Sabetta, W.; Blanco, A.; Pasqualone, A. DNA Microsatellite Region for a Reliable Quantification of Soft Wheat Adulteration in Durum Wheat-Based Foodstuffs by Real-Time PCR. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 10199–10204. [Google Scholar] [CrossRef]

25. Carloni, E.; Amagliani, G.; Omiccioli, E.; Ceppetelli, V.; Del Mastro, M.; Rotundo, L.; Brandi, G.; Magnani, M. Validation and Application of a Quantitative Real-Time PCR Assay to Detect Common Wheat Adulteration of Durum Wheat for Pasta Production. Food Chem. 2017, 224, 86–91. [Google Scholar] [CrossRef]

26. Fanelli, V.; Dellino, M.; Taranto, F.; De Giovanni, C.; Sabetta, W.; De Vita, P.; Montemurro, C. Varietal Identification in Pasta through an SSR-based Approach: A Case Study. J. Sci. Food Agric. 2023, 103, 5521–5528. [Google Scholar] [CrossRef]

27. Su, W.; Xu, H.; Sun, L.; Lu, C.; Wu, R. Genetic Diversity Analysis of Volunteer Wheat Based on SSR Markers. J. Genet. 2023, 102, 54. [Google Scholar] [CrossRef]

28. Ahmed, H.G.M.D.; Kashif, M.; Rashid, M.A.R.; Sajjad, M.; Zeng, Y. Genome Wide Diversity in Bread Wheat Evaluated by SSR Markers. Int. J. Agric. Biol. 2020, 24, 263–272. [Google Scholar] [CrossRef]

29. Dagnaw, T.; Mulugeta, B.; Haileselassie, T.; Geleta, M.; Ortiz, R.; Tesfaye, K. Genetic Diversity of Durum Wheat (Triticum Turgidum, L. Ssp. Durum, Desf) Germplasm as Revealed by Morphological and SSR Markers. Genes 2023, 14, 1155. [Google Scholar] [CrossRef]

30. Christov, N.K.; Tsonev, S.; Dragov, R.; Taneva, K.; Bozhanova, V.; Todorovska, E.G. Genetic Diversity and Population Structure of Modern Bulgarian and Foreign Durum Wheat Based on Microsatellite and Agronomic Data. Biotechnol. Biotechnol. Equip. 2022, 36, 637–652. [Google Scholar] [CrossRef]

31. Devi, S.; Singh, V.; Yashveer, S.; Dalal, M.S.; Paras; Chawla, R.; Akbarzai, D.K.; Chaurasia, H. Molecular Characterization of Bread Wheat (Triticum aestivum) Genotypes Using SSR Markers. Indian J. Agric. Sci. 2023, 93, 948–953. [Google Scholar] [CrossRef]

32. Jabari, M.; Golparvar, A.; Sorkhilalehloo, B.; Shams, M. Investigation of Genetic Diversity of Iranian Wild Relatives of Bread Wheat Using ISSR and SSR Markers. J. Genet. Eng. Biotechnol. 2023, 21, 73. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

33. Ismail, R.M.; Fathallah, F.B.; El-Shafei, A.; Shoaib, R.M.; Mahfouz, S.A.; EL-Demardash, I.S. Enhancing Wheat Genetic Resources through Diallel Crosses for Production of New Lines. Egypt. J. Agron. 2023, 45, 139–155. [Google Scholar] [CrossRef]

34. Kara, K.; Rached-Kanouni, M.; Mnasri, S.; Khammar, H.; Ben Naceur, M. Genetic Variability Assessment in Bread Wheat (Triticum Aestivum) Grown in Algeria Using Microsatellites SSR Markers. Biodiversitas 2020, 21, 6. [Google Scholar] [CrossRef]

35. Tahir, O.; Bangash, S.A.K.; Ibrahim, M.; Shahab, S.; Khattak, S.H.; Ud Din, I.; Khan, M.N.; Hafeez, A.; Wahab, S.; Ali, B.; et al. Evaluation of Agronomic Performance and Genetic Diversity Analysis Using Simple Sequence Repeats Markers in Selected Wheat Lines. Sustainability 2022, 15, 293. [Google Scholar] [CrossRef]

36. Tsonev, S.; Christov, N.K.; Mihova, G.; Dimitrova, A.; Todorovska, E.G. Genetic Diversity and Population Structure of Bread Wheat Varieties Grown in Bulgaria Based on Microsatellite and Phenotypic Analyses. Biotechnol. Biotechnol. Equip. 2021, 35, 1520–1533. [Google Scholar] [CrossRef]

37. Khodadadi, E.; Farokhzadeh, S. Assessing Genetic Diversity of Indigenous Bread and Durum Wheat Cultivars in Iran Using Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) Markers. Genet. Resour. Crop Evol. 2024, 71, 3135–3150. [Google Scholar] [CrossRef]

38. Ramos-Cabrer, A.M.; Fernández-Canto, N.; Almeida-García, F.; Gorostidi, A.; Lombardero-Fernández, M.; Romero-Rodríguez, M.Á.; Pereira-Lorenzo, S. Traceability of the Local Cultivar ‘Caaveiro’ in Flour Mixtures Used to Produce Galician Bread by Simple Sequence Repeats and Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Technology. Int. J. Food. Sci. Technol. 2022, 57, 7085–7098. [Google Scholar] [CrossRef]

39. Fernández-Canto, M.N.; García-Gómez, M.B.; Boado-Crego, S.; Vázquez-Odériz, M.L.; Muñoz-Ferreiro, M.N.; Lombardero-Fernández, M.; Pereira-Lorenzo, S.; Romero-Rodríguez, M.Á. Element Content in Different Wheat Flours and Bread Varieties. Foods 2022, 11, 3176. [Google Scholar] [CrossRef]

40. Fernández-Canto, N.; Romero-Rodríguez, M.Á.; Ramos-Cabrer, A.M.; Pereira-Lorenzo, S.; Lombardero-Fernández, M. Polarized Light Microscopy Guarantees the Use of Autochthonous Wheat in the Production of Flour for the Protected Geographical Indication ‘Galician Bread’. Food Control 2023, 147, 109597. [Google Scholar] [CrossRef]

41. Fdez-Vidal, X.R.; Fernández-Canto, N.; Romero-Rodríguez, M.Á.; Ramos-Cabrer, A.M.; Pereira-Lorenzo, S.; Lombardero-Fernández, M. Neural Networks Allow the Automatic Verification of the Type of Flour, Analysing the Starch Granule Morphology, to Ensure the Protected Geographical Indication ‘Galician Bread’. Food Control 2024, 158, 110198. [Google Scholar] [CrossRef]

42. Villa, T.C.C.; Maxted, N.; Scholten, M.; Ford-Lloyd, B. Defining and Identifying Crop Landraces. Plant Genet. Resour. 2005, 3, 373–384. [Google Scholar] [CrossRef]

43. Ruiz, M.; Giraldo, P.; Royo, C.; Villegas, D.; Aranzana, M.J.; Carrillo, J.M. Diversity and Genetic Structure of a Collection of Spanish Durum Wheat Landraces. Crop Sci. 2012, 52, 2262–2275. [Google Scholar] [CrossRef]

44. Peakall, R.; Smouse, P.E. GenAlEx 6.5: Genetic Analysis in Excel. Population Genetic Software for Teaching and Research—An Update. Bioinformatics 2012, 28, 2537–2539. [Google Scholar] [CrossRef]

45. Pritchard, J.K.; Stephens, M.; Donnelly, P. Inference of Population Structure Using Multilocus Genotype Data. Genetics 2000, 155, 945–959. [Google Scholar] [CrossRef]

46. Pritchard, J.K.; Stephens, M.; Rosenberg, N.A.; Donnelly, P. Association Mapping in Structured Populations. Am. J. Hum. Genet. 2000, 67, 170–181. [Google Scholar] [CrossRef]

47. Pereira-Lorenzo, S.; Ramos-Cabrer, A.M.; Barreneche, T.; Mattioni, C.; Villani, F.; Díaz-Hernández, B.; Martín, L.M.; Robles-Loma, A.; Cáceres, Y.; Martín, A. Instant Domestication Process of European Chestnut Cultivars. Ann. Appl. Biol. 2019, 174, 74–85. [Google Scholar] [CrossRef]

48. Porras-Hurtado, L.; Ruiz, Y.; Santos, C.; Phillips, C.; Carracedo, Á.; Lareu, M.V. An Overview of STRUCTURE: Applications, Parameter Settings, and Supporting Software. Front. Genet. 2013, 4, 98. [Google Scholar] [CrossRef]

49. Pereira-Lorenzo, S.; Urrestarazu, J.; Ramos-Cabrer, A.M.; Miranda, C.; Pina, A.; Dapena, E.; Moreno, M.A.; Errea, P.; Llamero, N.; Díaz-Hernández, M.B.; et al. Analysis of the Genetic Diversity and Structure of the Spanish Apple Genetic Resources Suggests the Existence of an Iberian Genepool. Ann. Appl. Biol. 2017, 171, 424–440. [Google Scholar] [CrossRef]

50. Alessandri, S.; Cabrer, A.M.R.; Martìn, M.A.; Mattioni, C.; Pereira-Lorenzo, S.; Dondini, L. Genetic Characterization of Italian and Spanish Wild and Domesticated Chestnut Trees. Sci. Hortic. 2022, 295, 110882. [Google Scholar] [CrossRef]

51. Evanno, G.; Regnaut, S.; Goudet, J. Detecting the Number of Clusters of Individuals Using the Software STRUCTURE: A Simulation Study. Mol. Ecol 2005, 14, 2611–2620. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

52. Excoffier, L.; Smouse, P.E.; Quattro, J.M. Analysis of Molecular Variance Inferred from Metric Distances among DNA Haplotypes: Application to Human Mitochondrial DNA Restriction Data. Genetics 1992, 131, 479–491. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

53. Michalakis, Y.; Excoffier, L. A Generic Estimation of Population Subdivision Using Distances Between Alleles With Special Reference for Microsatellite Loci. Genetics 1996, 142, 1061–1064. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

54. Pereira-Lorenzo, S.; Ramos-Cabrer, A.M.; Barreneche, T.; Mattioni, C.; Villani, F.; Díaz-Hernández, M.B.; Martín, L.M.; Martín, Á. Database of European Chestnut Cultivars and Definition of a Core Collection Using Simple Sequence Repeats. Tree Genet. Genomes 2017, 13, 114. [Google Scholar] [CrossRef]

55. Perrier, X.; Flori, A.; Bonnot, F. Data Analysis Methods. In Genetic Diversity of Cultivated Tropical Plants; Hamon, P., Seguin, M., Perrier, X., Glaszmann, J.C., Eds.; Science Publishers: Enfield, NH, USA; Montpellier, France, 2003; pp. 43–76. [Google Scholar]

56. Perrier, X.; Jacquemoud-Collet, J.P. DARwin Software. In Genetic Diversity of Cultivated Tropical Plants; Hamon, P., Seguin, M., Perrier, X., Glaszmann, J.C., Eds.; Science Publishers: Enfield, NH, USA; Montpellier, France, 2003; pp. 43–76. [Google Scholar]

57. IBM Corp. IBM SPSS Statistics for Windows, version 28.0; IBM Corporation: Armonk, NY, USA, 2021.

58. Goodman, L.A. The Analysis of Multidimensional Contingency Tables When Some Variables Are Posterior to Others: A Modified Path Analysis Approach. Biometrika 1973, 60, 179–192. [Google Scholar] [CrossRef]

59. Llauradó, M.; Moreno- González, J. Classification of Northern Spanish Populations of Maize by Methods of Numerical Taxonomy. I. Morphological Traits. Maydica 1993, 38, 15–21. [Google Scholar]

60. Pereira-Lorenzo, S.; Fernández-López, J.; Moreno-González, J. Variability and Grouping of Northwestern Spanish Chestnut Cultivars. I. Morphological Traits. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 1996, 121, 183–189. [Google Scholar] [CrossRef]

61. Earl, D.A.; VonHoldt, B.M. Structure Harvester: A Website and Program for Visualizing Structure Output and Implementing the Evanno Method. Conserv. Genet. Resour. 2012, 4, 359–361. [Google Scholar] [CrossRef]

62. Zhang, P.; Dreisigacker, S.; Buerkert, A.; Alkhanjari, S.; Melchinger, A.E.; Warburton, M.L. Genetic Diversity and Relationships of Wheat Landraces from Oman Investigated with SSR Markers. Genet. Resour. Crop Evol. 2006, 53, 1351–1360. [Google Scholar] [CrossRef]

63. Ballesta, P.; Maldonado, C.; Mora-Poblete, F.; Mieres-Castro, D.; del Pozo, A.; Lobos, G.A. Spectral-Based Classification of Genetically Differentiated Groups in Spring Wheat Grown under Contrasting Environments. Plants 2023, 12, 440. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

64. Mondini, L.; Farina, A.; Porceddu, E.; Pagnotta, M.A. Analysis of Durum Wheat Germplasm Adapted to Different Climatic Conditions. Ann. Appl. Biol. 2010, 156, 211–219. [Google Scholar] [CrossRef]

65. Alipour, H.; Bihamta, M.R.; Mohammadi, V.; Peyghambari, S.A.; Bai, G.; Zhang, G. Genotyping-by-Sequencing (GBS) Revealed Molecular Genetic Diversity of Iranian Wheat Landraces and Cultivars. Front. Plant Sci 2017, 8, 1293. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

66. Amallah, L.; Taghouti, M.; Rhrib, K.; Gaboun, F.; Arahou, M.; Hassikou, R.; Diria, G. Validation of Simple Sequence Repeats Associated with Quality Traits in Durum Wheat. J. Crop Sci. Biotechnol 2016, 19, 137–150. [Google Scholar] [CrossRef]

67. Arora, A.; Kundu, S.; Dilbaghi, N.; Sharma, I.; Tiwari, R. Population Structure and Genetic Diversity among Indian Wheat Varieties Using Microsatellite (SSR) Markers. Aust. J. Crop Sci. 2014, 8, 1281–1289. [Google Scholar]

68. Zeven, A.C. Landraces: A Review of Definitions and Classifications. Euphytica 1998, 104, 127–139. [Google Scholar] [CrossRef]

69. Brown, A.H.D. Isozymes, Plant Population Genetic Structure and Genetic Conservation. Theor. Appl. Genet. 1978, 52, 145–157. [Google Scholar] [CrossRef]

70. Zeven, A.C. Traditional Maintenance Breeding of Landraces: 1. Data by Crop. Euphytica 2000, 116, 65–85. [Google Scholar] [CrossRef]

71. Miyahara, T.; Miyake, N.; Sawahuji, K.; Kitta, K.; Nakamura, K.; Kondo, K.; Ozeki, Y. Wheat DNA Fragmentation of Commercial Processed Foods II. Mater. Methods. 2016, 23, 141–148. [Google Scholar]

Urquijo-Zamora L, Pereira-Lorenzo S, Romero-Rodríguez Á, Lombardero-Fernández M, Ramos-Cabrer AM, Fernández-Otero CI. Genetic Diversity of Local Wheat (Triticum aestivum L.) and Traceability in the Production of Galician Bread (Protected Geographical Indication) by Microsatellites. Agriculture. 2025; 15(1):51. https://doi.org/10.3390/agriculture15010051

Перевод статьи «Genetic Diversity of Local Wheat (Triticum aestivum L.) and Traceability in the Production of Galician Bread (Protected Geographical Indication) by Microsatellites» авторов Urquijo-Zamora L, Pereira-Lorenzo S, Romero-Rodríguez Á, Lombardero-Fernández M, Ramos-Cabrer AM, Fernández-Otero CI., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык

Фото: wikipedia