Опубликовано 20.07 15:00

Гриб-помощник долгоносика: как Penicillium herquei разлагает растения и защищает личинки

Взаимовыгодные симбиотические отношения насекомых и грибов, основанные на выращивании последних, служат моделью для изучения коэволюции видов. По сравнению с хорошо документированным выращиванием грибов у общественных насекомых, молекулярные аспекты подобных симбиотических отношений у несоциальных насекомых изучены слабо.

Euops chinensis — это одиночный листосворачивающий долгоносик, питающийся горцем японским (Fallopia japonica). Этот вредитель развил особый протоземледельческий двусторонний симбиоз с грибом Penicillium herquei, который обеспечивает питание и защитную функцию для личинок E. chinensis. В данной работе был секвенирован геном P. herquei, а затем структура и специфические категории генов в геноме P. herquei были всесторонне сравнены с двумя другими хорошо изученными видами пеницилла (P. decumbens и P. chrysogenum). Собранный геном P. herquei имел размер 40,25 Мб с содержанием ГЦ 46,7%. В геноме P. herquei был обнаружен разнообразный набор генов, ассоциированных с ферментами, активными в отношении углеводов, деградацией целлюлозы и гемицеллюлозы, транспортерами и биосинтезом терпеноидов. Сравнительная геномика показывает, что три вида пеницилла обладают сходным метаболическим и ферментативным потенциалом, однако P. herquei имеет больше генов, связанных с разложением растительной биомассы и защитой, но меньше генов, ассоциированных с вирулентностью и патогенностью. Наши результаты предоставляют молекулярные доказательства разрушения растительного субстрата и защитных ролей P. herquei в симбиотической системе E. chinensis. Большой метаболический потенциал, общий для видов пеницилла на уровне рода, может объяснять, почему некоторые виды пеницилла рекрутируются долгоносиками Euops в качестве культивируемых грибов.

Многие насекомые установили разнообразные ассоциации с микроорганизмами, и среди них симбиотические отношения насекомых и грибов являются одними из наиболее изученных в природе (Biedermann and Vega, 2020). Многие эусоциальные и субсоциальные насекомые, такие как муравьи (Mueller et al., 2001), термиты (Aanen, 2006) и амброзиевые жуки (Kirkendall et al., 2015), демонстрируют сложные формы взаимовыгодных отношений с грибами (симбиотические отношения по выращиванию грибов), которые позволяют этим насекомым культивировать свои грибные культуры на соответствующих субстратах, и, в свою очередь, эти насекомые в обязательном порядке полагаются на потребление своих грибных культур для получения ключевых питательных веществ и/или определенных услуг, таких как защита от врагов (Biedermann and Vega, 2020). Взаимовыгодные симбиотические отношения между грибами и насекомыми, выращивающими грибы, служат моделью для изучения коэволюционных взаимодействий между видами (Nygaard et al., 2016; Solomon et al., 2019; Biedermann and Vega, 2020; Pereira and Kjellberg, 2021). По сравнению с хорошо документированными симбиотическими отношениями по выращиванию грибов у некоторых общественных насекомых, выращивание грибов несоциальными организмами встречается редко, но включает некоторые примеры, такие как жук-ящерица Doubledaya bucculenta (Toki et al., 2012), долгоносики рода Euops (Coleoptera: Attelabidae) (Sawada and Morimoto, 1986; Kobayashi et al., 2008; Li et al., 2012), морской брюхоногий моллюск (Silliman and Newell, 2003) и несколько видов рыб-дамселов (Hata and Kato, 2006). Биологические и молекулярные аспекты симбиотических отношений по выращиванию грибов у одиночных несоциальных насекомых изучены слабо.

Биоинформатический анализ геномной последовательности грибного симбионта может быть использован для обнаружения молекулярных механизмов, ответственных за симбиотическую ассоциацию, питание, патогенность и/или защитную функцию (Fan et al., 2015; Fu et al., 2020). Более того, сравнительная геномика является полезным инструментом для лучшего понимания молекулярных основ симбиотических отношений по выращиванию грибов у насекомых (Nygaard et al., 2011; Poulsen et al., 2014). Многие молекулярные и геномные исследования в последние годы предоставили новое понимание установления (Mueller et al., 2018), сохранения (Schmidt et al., 2022), распознавания и специфичности адаптаций (da Costa et al., 2019; Skelton et al., 2019; Goes et al., 2020) у насекомых, выращивающих грибы, и их симбиотических грибных партнеров. Имеющиеся данные показывают, что симбиотические партнеры имеют решающее значение для выживания насекомых-хозяев (Schmidt et al., 2022), формирования фенотипического разнообразия (Gohli et al., 2017; Solomon et al., 2019) и происхождения различных экологических ниш (Six, 2020). Симбиотические отношения по выращиванию грибов могут приводить к развитию специализированных органов с уникальным развитием (Mayers et al., 2022), новым метаболическим возможностям (Huang et al., 2019; Schmidt et al., 2022), улучшенной защите от естественных врагов или других стрессов (Pathak et al., 2019), а также к сокращению или расширению новых генов (Nygaard et al., 2016). Выяснение того, как симбиотические отношения по выращиванию грибов влияют на гены и геномы, необходимо для лучшего понимания эволюции грибов с точки зрения молекулярных последовательностей.

Долгоносики рода Euops (Attelabidae) представляют собой интересные модельные системы для изучения симбиотических отношений по выращиванию грибов у несоциальных насекомых (Sakurai, 1985; Kobayashi et al., 2008; Grebennikov and Leschen, 2010; Li et al., 2012). Все виды этого рода развили взаимовыгодные отношения с грибами (Sawada and Morimoto, 1986). Euops chinensis Voss (Coleoptera: Attelabidae) является одиночным листосворачивающим долгоносиком, питающимся горцем японским Fallopia japonica (Houtt.) Ronse Decraene (Wang et al., 2010). Этот вредитель развил особый протоземледельческий двусторонний симбиоз с грибом Penicillium herquei, при котором взрослые самки переносят гриб в специализированном органе транспорта грибов, называемом мицетангием (Francke-Grosmann, 1967; Grebennikov and Leschen, 2010), и инокулируют грибные споры в листовые свертки перед откладкой яиц (Li et al., 2012). Интересно, что два других листосворачивающих долгоносика Euops, Euops lespedezae (Kobayashi et al., 2008) и Euops splendida (Sakurai, 1985), также были описаны как образующие симбиотические отношения по выращиванию грибов с видами Penicillium. Однако система Euops — Penicillium остается малоизученной по сравнению с другими насекомыми, выращивающими грибы, такими как муравьи и термиты.

Хотя E. chinensis имеет обязательную зависимость от P. herquei в отношении питания и защиты, как и другие насекомые, выращивающие грибы, его поведение при выращивании грибов, по-видимому, отличается от такового у общественных насекомых тем, что самки долгоносиков не поддерживают постоянно культивируемый материал, поскольку листовые свертки отделяются от растений и постепенно разлагаются (Li et al., 2012; Wang et al., 2015), и, следовательно, P. herquei ведет сапрофитный образ жизни при росте на листовых свертках. Было показано, что этот грибной культивар вертикально передается долгоносиком (Li et al., 2016) и обязательно приносит пользу развитию E. chinensis путем изменения химического состава листовых свертков (Li et al., 2012) и защиты листовых свертков от растительных патогенов (Wang et al., 2015), а также служит источником пищи для личинок (Wang et al., 2010; Li et al., 2012). Таким образом, рост, развитие и выживание E. chinensis значительно зависят от P. herquei (Li et al., 2012).

В этом исследовании мы предоставляем первое подробное описание генома P. herquei. Структура, метаболические возможности, кластеры генов вторичных метаболитов и важные патогенные характеристики генома P. herquei были затем всесторонне сравнены с двумя другими хорошо изученными видами Penicillium, P. chrysogenum и P. decumbens. Полученные результаты позволят получить новые сведения о молекулярных основах симбиотических отношений по выращиванию грибов в системе Euops — Penicillium.

Выделение гриба и условия культивирования

Листовые свертки, построенные E. chinensis, были собраны в провинции Цзянси (N27°46′16.33, E114°23′38.30), Китай, в начале мая 2021 года. Penicillium herquei с листовых свертков был выделен в соответствии с методами Li et al. (2012), и гриб культивировали на чашках с картофельно-декстрозным агаром (PDA). Штамм Penicillium herquei XQL_2021 был очищен путем выделения из одной споры и хранился при –80°C до использования. Для выделения геномной ДНК и секвенирования грибной штамм культивировали на чашках PDA в течение 2 недель при 25°C, затем споры собирали путем промывания стерильной дистиллированной водой, аликвоту 1 мл суспензии спор добавляли в 20 мл картофельно-декстрозного бульона (PDB) в 50-мл конических колбах и культивировали при 25°C на ротационном шейкере при 200 об/мин в течение 3 дней. Грибной мицелий собирали в стерильные пробирки путем фильтрации культуральной жидкости с тщательным промыванием стерилизованной водой. Собранный мицелий затем тщательно промывали стерилизованной водой, немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при –80°C до использования.

Выделение геномной ДНК и секвенирование

Около 2,0 г аликвот мицелия (свежий вес) было собрано, и геномная ДНК была выделена на основе метода цетилтриметиламмония бромида (CTAB) (Porebski et al., 1997). Количество и качество выделенной геномной ДНК проверяли с использованием Nanodrop (Thermo Scientific, США).

Для коротких прочтений секвенирование проводили на платформе NovaSeq 6000, и библиотека крупных фрагментов была подготовлена с использованием набора NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit для Illumina (NEB, США). Библиотеку количественно оценивали с использованием прибора Agilent 2100 биоанализатор (реагенты Agilent DNA 1000; Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США) и полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-qPCR). Квалифицированные библиотеки амплифицировали в проточной ячейке на приборе Illumina cBOT для генерации кластеров (набор NovaSeq 6000 PE cluster kit; Illumina). Проточную ячейку с кластерами загружали в секвенатор NovaSeq 6000 (набор NovaSeq 6000 SBS kit; Illumina) для парно-концевого секвенирования с рекомендуемой длиной прочтений 150 п.н. Сырые прочтения фильтровали с использованием инструмента SOAPnuke (v2.1.4) для удаления прочтений с адаптерами или неизвестными нуклеотидами, а также низкокачественных прочтений с ≥50% низкокачественных оснований. После фильтрации данных очищенные данные использовали для последующего анализа.

Для длинных прочтений секвенирование проводили на платформе Nanopore PromethION, и библиотеки были подготовлены с использованием набора для лигирования Oxford Nanopore (SQK-LSK109) в соответствии со стандартным протоколом. Очищенную библиотеку загружали в подготовленную проточную ячейку R9.4 Spot-On (FLO-MIN106), и секвенирование выполняли на секвенаторе PromethION (Oxford Nanopore Technologies, Оксфорд, Великобритания) в течение 48 часов в компании Wuhan Benagen Technology Company Limited (Ухань, Китай). Полученные файлы FAST5 преобразовывали с использованием программного обеспечения Oxford Nanopore GUPPY (v0.3.0), и прочтения с качеством ≤7 были отброшены.

Сборка и аннотация генома

Сборку генома выполняли с использованием NECAT. Два раунда коррекции ошибок проводили с использованием Racon (v1.4.3) (Vaser et al., 2017) и Pilon (v1.23) на основе данных секвенирования Nanopore и Illumina Novaseq соответственно (Walker et al., 2014). Гетерозиготные последовательности удаляли с использованием конвейера Purge_haplotigs (v1.0.4) (Roach et al., 2018). Предсказание генов на основе гомологии выполняли с использованием SNAP (Johnson A.D. et al., 2008), AUGUSTUS v 3.2.1 (Stanke et al., 2006) и GeneMark-ES v4.21 (Ter-Hovhannisyan et al., 2008). BUSCO (v4.1.2) на основе эталонной базы данных fungi_odb10 использовали для оценки качества предсказания (Waterhouse et al., 2018). Области тРНК и вторичные структуры обнаруживали с использованием tRNAscan-SE v1.23. рРНК анализировали с использованием программного обеспечения RNAmmer (Lagesen et al., 2007), а малые РНК предсказывали с использованием Infernal v1.1.2 для поиска по базе данных Rfam 9.1 (Gardner et al., 2009). Для оценки мобильных генетических элементов в геноме P. herquei мобильные элементы искали с использованием базы данных Repbase (Bao et al., 2015) с помощью RepeatMasker v4.0.93.

Для функциональной аннотации BLASTP использовали для поиска по ряду белковых баз данных, включая UniProt/Swiss-Prot (Bairoch et al., 2005), базу данных неидентичных белковых последовательностей (NR) в NCBI, Gene Ontology (GO) (Gene Ontology Consortium, 2004), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Kanehisa and Goto, 2000) и Cluster of Orthologous Groups (COG) (Tatusov et al., 2003) с порогом <1e–05, и наилучшее совпадение использовали для вывода биологической функции гена.

Ортология генов и филогенетический анализ

Эталонные геномные последовательности других 14 видов аскомицетов (см. дополнительные таблицы S1, S2 в дополнительных материалах) были загружены из базы данных NCBI и использованы для построения семейств генов. Выравнивание последовательностей выполняли с помощью MUSCLE (Edgar, 2004), и позиции, содержащие пропуски ≥80% в множественном выравнивании последовательностей, были обрезаны с использованием TrimaAI v1.4. rev22 (Capella-Gutiérrez et al., 2009). Сравнение и аннотацию ортологичных кластеров генов проводили с использованием OrthoFinder 2.2.7 (Emms and Kelly, 2019). Филогенетические деревья строили с использованием метода максимального правдоподобия, реализованного в RAxML v8.0 (Stamatakis, 2014), последовательность Coccidioides immitis (Stiles) (номер доступа GenBank GCA_000146045.2) использовали в качестве внешней группы. Расширение и сокращение семейств генов определяли с использованием CAFE v4.2 (De Bie et al., 2006). Филогению с калибровкой по времени выводили в байесовской системе с использованием ископаемой информации (Drummond and Rambaut, 2007). Представленные хронограммы были рассчитаны с использованием дерева медианной достоверности клад и 95% доверительных интервалов. Программа PAML mcmctree v4.5 (Yang and Rannala, 2006) использовалась для вычисления времени расхождения с использованием алгоритма приближенного вычисления правдоподобия. Модель эволюции последовательностей определяли с использованием Modeltest 3.75. Tracer v1.5.06 применяли для проверки сходимости, и для подтверждения выполняли два независимых запуска.

Сравнение геномов трех видов Penicillium

Для лучшего понимания геномных характеристик P. herquei в контексте рода Penicillium геном P. herquei сравнивали с геномами двух других хорошо изученных видов Penicillium — P. chrysogenum (номер доступа GenBank: GCA_000149335.2) и P. decumbens (номер доступа GenBank: GCA_002072245.1). Семейства генов были созданы с помощью программного обеспечения MCL (v12-068) с использованием значения инфляции 2,0 (Enright et al., 2002). BLASTp использовали для сравнения всех белковых последовательностей трех выбранных видов, результаты фильтровали с использованием пороговых значений e ≤1e–5, идентичности выравнивания ≥30% и покрытия выравнивания ≥50%. GO-аннотацию выполняли с использованием Blast2GO, который присваивал гомологичным последовательностям, выровненным с помощью BLAST с Uniprot и базой данных NR, термины GO. Затем анализировали количество общих и специфических семейств генов среди трех видов Penicillium.

Аннотация специфических категорий генов в геномах трех видов Penicillium

Гены, связанные с деградацией целлюлозы и гемицеллюлозы: ферменты, активные в отношении углеводов (CAZymes), у трех видов Penicillium были аннотированы с использованием BLAST (Johnson M. et al., 2008). Программа аннотации dbCAN HMMER 3 (Finn et al., 2011) использовалась для поиска по базе данных CAZy (ферменты, активные в отношении углеводов) (Lombard et al., 2014). Результаты объединяли при значениях e ≤1e–5. Пероксидазы класса II и пероксидазы, обесцвечивающие красители, были дополнительно подтверждены поиском BLAST по базе данных PeroxiBase (Fawal et al., 2012).

Гены вторичного метаболизма: гены-кандидаты транспортеров у трех видов Penicillium были идентифицированы на основе поиска в базе данных классификации транспортеров (TCDB) (Saier et al., 2014) со значениями e ≤1e–5 и значениями идентичности ≥40%. Гены биосинтеза вторичных метаболитов и кластеры генов в геномах трех видов Penicillium были предсказаны с помощью AntiSMASH 6.0 (Blin et al., 2021). Всеобъемлющая база данных по исследованию антибиотиков (CARD) (McArthur et al., 2013) использовалась для сравнения кодирующих генов (трех видов Penicillium), участвующих в противомикробной резистентности.

Гены, ассоциированные с вирулентностью: гены-кандидаты взаимодействий патоген-хозяин (PHI) в геноме трех видов Penicillium были идентифицированы с использованием BLASTp для поиска по PHI-base v4.37, и выравнивания белков выполняли для выявления предполагаемых генов, ассоциированных с вирулентностью, у трех видов Penicillium с идентичностью ≥40% и покрытием запроса ≥70%.

Общая структура генома Penicillium herquei

После контроля качества мы получили 10,829 Гб данных NovaSeq (269-кратное покрытие) и 16,343 Гб данных Nanopore (406-кратное покрытие). Комбинированные последовательности с двух платформ были собраны в 65 скаффолдов со значением N50 414 225 п.н. для получения общего размера генома 40,25 Мб (содержание ГЦ 46,72%) (Таблица 1). Мы предсказали 14 532 гена со средней длиной 2 275 п.н., и 96,12% белок-кодирующих генов имели значительную гомологию с ранее документированными грибными последовательностями (Таблица 1). BUSCO использовали для расчета полноты сборки и аннотации. Среди 1875 одно-копийных ортологов 75,6% контигов были полными и 16,4% контигов были полными дублированными BUSCO, в то время как только 0,7% были фрагментированными и 7,4% отсутствовали.

Таблица 1 Характеристики генома Penicillium herquei.

Сборка генов и аннотация

Из предсказанных генов 8 751 (60,22%) показали гомологию с известными белками в базе данных NR, и 70,87% этих генов показали значительные совпадения с известными белками 9 видов Penicillium (дополнительная таблица S3). Мы обнаружили 49 056 экзонов со средней длиной 421,53 п.н. Средняя длина интронов составляла 100,23 нуклеотида. Что касается некодирующих РНК (нкРНК), в геноме P. herquei было идентифицировано 185 генов тРНК, 41 ген рРНК и 40 генов мяРНК (дополнительная таблица S4). Мы идентифицировали 458 687 п.н. повторяющихся элементов в геноме P. herquei (1,14% геномной последовательности). Тандемные повторяющиеся последовательности составляли 0,04%, а мобильные элементы — 1,69% собранного генома, при этом неизвестные и другие повторяющиеся элементы составляли 0,02% генома. Длинные концевые повторы (ДКП) были наиболее распространенными мобильными элементами и составляли около 0,43% геномной последовательности (дополнительная таблица S4).

Результаты аннотации COG показали, что 1 227 генов были классифицированы в 24 типа генов, что составляет 8,44% от общего числа генов у P. herquei, как показано на Рисунке 1. Результаты функциональной аннотации в базе данных GO показали, что 8 665 генов (59,63% всех генов) можно классифицировать по трем типам, из которых 7 114 генов относятся к компонентам клетки, 7 585 генов — к молекулярным функциям и 7 086 генов — к биологическим процессам. Терминами GO с наибольшим числом генов, классифицированных как относящиеся к биологическим процессам, были гены, связанные с трансмембранным транспортом (405 генов). Терминами GO с наибольшим числом генов, классифицированных как относящиеся к компонентам клетки, были ядро (2 055 генов) или интегральные компоненты мембран (641 ген). Терминами GO с наибольшим числом генов, классифицированных как относящиеся к молекулярной функции, были связывание АТФ (944 гена, 16,17%) и связывание ионов металлов (873 гена, 14,95%) (дополнительный рисунок S1). Результаты анализа путей KEGG показали, что 6 638 (45,67%) генов были классифицированы как относящиеся к 338 известным метаболическим путям. Метаболическим путем с наибольшим числом генов был метаболизм аминокислот (771 ген), за которым следовали метаболизм углеводов (743 гена) и трансдукция сигналов (593 гена). Кластерный анализ показал, что соответствующие 338 метаболических путей можно разделить на пять групп: метаболизм, обработка генетической информации, системы организмов, клеточные процессы и обработка информации об окружающей среде (дополнительный рисунок S2).

Рисунок 1 Функциональная аннотация COG кодирующих последовательностей во всем геноме Penicillium herquei.

Ортология генов и филогенетический анализ

OrthoFinder идентифицировал 2 852 кластера генов, среди которых было 48 701 ортологичных генов, общих для всех 15 рассмотренных видов грибов. Из этих общих кластеров генов было выбрано 23 220 одно-копийных ортологичных генов для анализа эволюционных взаимоотношений P. herquei с другими 14 эталонными геномами грибов. Примечательно, что геном P. herquei содержит больше много-копийных ортологов, но меньше одно-копийных ортологов, чем геномы других 14 исследованных видов грибов (дополнительный рисунок S3). Филогенетический анализ показал, что P. herquei кластеризуется с другими видами Penicillium и наиболее близок к фитопатогенному грибу P. decumbens (Рисунок 2). Более того, в геноме P. herquei значительно сократились 49 генов и 419 семейств генов, но значительно расширились 4 878 генов и 1 900 семейств генов. По сравнению с другими видами грибов, P. herquei имел самое высокое соотношение расширенных семейств генов к сокращенным (Рисунок 2).

Рисунок 2 Филогенетическое дерево Penicillium herquei и последовательностей 14 видов грибов, доступных в GenBank. Синие цифры на узлах — это время расхождения в миллионах лет назад. Числа для значительно расширенных (+, зеленый) и сокращенных (–, красный) семейств генов показаны под ветвями или названиями таксонов с процентами, указанными на круговых диаграммах.

Сравнительная геномика трех видов Penicillium

Размер генома (40,25 Мб) был больше, но содержание ГЦ (46,7%) было ниже у P. herquei по сравнению с двумя другими исследованными видами Penicillium (P. chrysogenum: 32,52 Мб с содержанием ГЦ 48,9%; P. decumbens: 23,94 Мб с содержанием ГЦ 50,2%). Три вида Penicillium имели общие 5 309 семейств генов (Рисунок 3A). Помимо основных семейств генов, присутствующих у всех трех видов, P. herquei имел больше общих семейств генов с P. chrysogenum, чем с P. decumbens. Было 239 семейств генов, уникально общих для P. herquei и P. decumbens, в то время как 1 675 семейств генов были уникально общими для P. herquei и P. chrysogenum. Общие и специфические семейства генов у трех видов Penicillium были классифицированы с помощью GO-анализа в соответствии с их связанными биологическими процессами (Рисунок 3B). Большинство из 5 309 основных семейств (круг I) были классифицированы по функциональным категориям клеточных и метаболических процессов, но приблизительно половина специфических для вида семейств генов (круги V–VII) не могли быть отнесены к определенной категории GO (Рисунок 3B). Результаты аннотации COG показали, что P. herquei имел больше генов, участвующих в транспорте веществ и метаболизме, включая те, которые сгруппированы в группы «транспорт липидов и метаболизм», «транспорт углеводов и метаболизм», «транспорт аминокислот и метаболизм» и «биосинтез, транспорт и катаболизм вторичных метаболитов» (Рисунок 3C).

Рисунок 3 (A) Диаграмма Венна, показывающая количество общих и специфических семейств генов среди трех видов Penicillium: P. herquei (Pher), P. chrysogenum (Pchr) и P. decumbens (Pdec). (B) Категории Gene Ontology (GO) семейств генов в соответствии с биологическим процессом. Круги I–VII соответствуют областям I–VII на A. (C) Сравнительный анализ генов по функциональным категориям Cluster of Orthologous Groups (COG) из геномов P. herquei, P. chrysogenum и P. decumbens.

Аннотация специфических категорий генов в геномах трех видов Penicillium

Гены, связанные с деградацией целлюлозы и гемицеллюлозы: мы идентифицировали 608 ферментов CAZymes в геноме P. herquei, состоящих из 285 гликозидгидролаз (GH), 103 гликозилтрансфераз (GT), 95 ферментов с вспомогательной активностью (AA), 92 углеводных эстераз (CE), 28 углевод-связывающих модулей (CBM) и 5 полисахаридлиаз (PL) (Рисунок 4A). Penicillium herquei имел больше генов CAZymes (особенно генов, кодирующих GH, CE и AA), чем два других вида Penicillium (P. chrysogenum — 477 и P. decumbens — 249) (Рисунок 4A). Более того, в геноме P. herquei было также обнаружено много генов, кодирующих GH и CE, связанных с деградацией целлюлозы и гемицеллюлозы. В частности, в геноме P. herquei было больше генов GH6 и GH7, связанных с деградацией целлюлозы, а также генов GH35, GH67, CE16 и CE1, связанных с деградацией гемицеллюлозы, чем у двух других видов Penicillium (Рисунки 4B, C).

Рисунок 4 Сравнение генов, кодирующих ферменты, активные в отношении углеводов (CAZymes) (A–C), и генов вторичных метаболитов (D–F) у Penicillium herquei (Pher), Penicillium chrysogenum (Pchr) и Penicillium decumbens (Pdec). (A) CAZymes, идентифицированные в геноме Pher, Pchr и Pdec. PL — полисахаридлиаза; GT — гликозилтрансфераза; GH — гликозидгидролаза; CE — углеводная эстераза; CBM — углевод-связывающий модуль; AA — вспомогательная активность. CAZymes, участвующие в деградации целлюлозы (B) и деградации гемицеллюлозы (C). (D) Гены биосинтеза вторичных метаболитов. PKS — поликетидсинтаза; NRPS — нерибосомальная пептидсинтетаза. (E) Гены, кодирующие транспортеры. MFS — суперсемейство главных переносчиков, ABC-транспортеры (ATP-binding cassette). (F) Гены устойчивости к противомикробным препаратам, идентифицированные в базе данных CARD.

Гены вторичного метаболизма: мы идентифицировали 2 346 транспортных белков в геноме P. herquei, больше, чем у двух других видов Penicillium. Среди этих транспортеров 54 гена кодировали белки суперсемейства главных переносчиков (MFS) и 22 — белки ABC (ATP-binding cassette) (Рисунок 4D). Анализ AntiSMASH показал, что число предсказанных генов вторичных метаболитов в геноме P. herquei (520) было сравнимо с числом этих генов в геноме P. chrysogenum (566), но было выше, чем в геноме P. decumbens (254). Эти гены вторичных метаболитов включали гены, кодирующие поликетидсинтазу I типа (T1PKS), нерибосомальные пептидсинтетазы (NRPS) и NRPS-подобные ферменты (Рисунок 4E). В частности, геном P. herquei содержал 42 гена терпенсинтаз, что больше, чем число таких ферментов у двух других видов Penicillium (Рисунок 4E). CARD идентифицировала четыре гена устойчивости к противомикробным препаратам в геномах трех видов Penicillium, включая бета-лактамазу, трансферазу, белки защиты и резистентности, а также кластер генов устойчивости к гликопептидам. Число этих генов у P. herquei было выше, чем у двух других видов Penicillium (Рисунок 4F).

Гены, ассоциированные с вирулентностью: мы предсказали в общей сложности 99 031 ген PHI в геноме P. herquei; наибольшая доля генов PHI была связана со «сниженной вирулентностью» (38,00%), за которой следовали «неизмененная патогенность» (34,65%), «потеря патогенности» (9,95%) и «смешанный результат» (10,90%) (Рисунок 5A). Хотя P. herquei имел больше генов PHI, чем P. chrysogenum (77 638) и P. decumbens (49 326), гены PHI, связанные со сниженной вирулентностью, неизмененной патогенностью или потерей патогенности, были более многочисленны в геноме P. herquei, чем у двух других видов Penicillium (Рисунок 5B).

Рисунок 5 Предполагаемые гены взаимодействий патоген-хозяин (PHI). (A) Распределение фенотипических категорий ортологов генов PHI в геноме Penicillium herquei. (B) Сравнение генов PHI у трех видов Penicillium: P. herquei (Pher), P. chrysogenum (Pchr) и P. decumbens (Pdec).

Качество сборки в значительной степени зависит от размера генома. Мы обнаружили, что размер генома P. herquei (40,25 Мб) был больше, чем у двух исследованных видов Penicillium — P. chrysogenum (23,94 Мб) и P. decumbens (32,52 Мб). Аналогично, Raffaelea ambrosiae, симбионт амброзиевых жуков Platypus, имел больший размер генома (40,78 Мб) (Vanderpool et al., 2018), чем его близкий не-амброзиевый родственник Ophiostoma piceae (32,84 Мб) (Haridas et al., 2013). Однако Ambrosiella cleistominuta, грибной симбионт амброзиевого жука Anisandrus maiche, имел сходный размер генома (27,08 Мб) (Wilken et al., 2020) со своим близким не-амброзиевым родственником Ceratocystis fimbriata (31,61 Мб) (Santos et al., 2020). Поскольку многие грибы являются высокогетерозиготными и полиплоидными, сборки их геномов часто сильно фрагментированы, и разные сборщики могут генерировать разные размеры сборки. Kooij и Pellicer (2020) считают, что опубликованные фрагментированные сборки геномов завышают размеры геномов полиплоидных грибных симбионтов.

Эволюция геномов и генов грибов позволяет им существовать в различных средах, и паттерны расширения или сокращения семейств генов могут отражать определенное давление отбора, которому вид подвергался в течение эволюционных временных масштабов (Nygaard et al., 2011, 2016). Как расширение, так и сокращение семейств генов были обнаружены в геноме P. herquei, что согласуется с геномами других грибных культиваров термитов (Poulsen et al., 2014) и листорезных муравьев (Aylward et al., 2013). Например, геном Termitomyces sp., культивируемого термитом Macrotermes natalensis, показал 10 расширений семейств генов, но 4 сокращения семейств генов (Poulsen et al., 2014). Гриб Leucoagaricus gongylophorus, культивируемый листорезными муравьями, имеет расширение лигноцеллюлаз (Aylward et al., 2013). Расширение или сокращение семейств генов, вероятно, было вызвано симбиотическими отношениями между насекомыми, выращивающими грибы, и их обязательными культиварами (Poulsen et al., 2014; Nygaard et al., 2016). Эволюционные модификации в геномах муравьев-аттин включают беспрецедентные темпы перестройки генома в целом, раннюю потерю биосинтеза аргинина и положительный отбор по путям хитиназ, и, соответственно, реципрокная геномная эволюция их грибных культиваров включает потерю ключевого домена лигниназы, изменения в синтезе хитина и сокращение ферментов, деградирующих углеводы (Nygaard et al., 2016).

Penicillium herquei принадлежит к секции Sclerotiora рода Penicillium, и хотя грибные виды этой секции обычно встречаются в почве, растениях и насекомых (Houbraken and Samson, 2011), филогения этой секции все еще слабо изучена. Более того, род Penicillium относится к семейству Aspergillaceae и содержит два подрода — Aspergilloides и Penicillium (Houbraken and Samson, 2011). Мы также заметили, что P. herquei филогенетически принадлежит к Aspergilloides, в то время как два других вида Penicillium, с которыми мы сравнивали, филогенетически принадлежат к подроду Penicillium (Houbraken and Samson, 2011). Таким образом, будущее изучение геномов других более близких родственников в подроде Aspergilloides было бы полезно для получения дополнительной информации о P. herquei.

Клеточная стенка растений является важным барьером против атак насекомых, однако большинство насекомых не имеют эндогенных ферментов для переваривания клеточной стенки растений (Tokuda, 2019). Чтобы преодолеть барьер клеточной стенки растений, многие насекомые установили тесные ассоциации с грибами (Calderón-Cortés et al., 2012), поскольку те могут секретировать разнообразный набор ферментов, таких как целлюлаза, гемицеллюлаза и пектиназа и др., способных разрушать полимеры клеточной стенки (Kubicek et al., 2014). Среди них CAZymes отвечают за метаболизм глиоконъюгатов, олигосахаридов и полисахаридов и играют ключевую роль в синтезе и деградации углеводов (Hage and Rosso, 2021) и во взаимодействиях хозяин-патоген (Kubicek et al., 2014). В нашем анализе P. herquei имел больше генов, связанных с CAZymes, чем два исследованных вида Penicillium, и он также имеет большое количество генов, ассоциированных с деградацией целлюлозы и гемицеллюлозы, которые играют важную роль в эффективном разрушении клеточных стенок растений на питательные вещества, такие как глюкоза, манноза, галактоза, уксусная кислота и ксилоза (Knowles et al., 1987; Yang et al., 2007). Эти гены помогают разрушать клеточные стенки листовых свертков, которыми питаются личинки E. chinensis, обеспечивая дополнительные питательные вещества для роста личинок. Мы также показали, что P. herquei может изменять химические компоненты листьев, снижая содержание целлюлозы в листовых свертках (Li et al., 2012). GH являются распространенными ферментами, которые могут разрушать целлюлозу, гемицеллюлозу и крахмал и участвуют в гидролизе гликозидной связи между или внутри молекул углеводов (Wyman et al., 2005; Sammond et al., 2012). В нашем исследовании гены, кодирующие ферменты классов GH7, GH6, GH35 и GH67, превосходили по численности гены, кодирующие другие ферменты GH, что указывает на то, что этот гриб обладает более высокой способностью разрушать целлюлозу и гемицеллюлозу, чем два других изученных вида Penicillium.

Более высокое число генов, связанных с CAZymes, и генов, ассоциированных с деградацией целлюлозы и гемицеллюлозы, в геноме P. herquei может указывать на его естественную историю. Помимо того, что P. herquei является симбионтом E. chinensis, он широко встречается в почве, подстилке, плодах и как эндофитный гриб растений в природе (Tansakul et al., 2014; Zhou et al., 2019). Таким образом, этот гриб, возможно, развил эти гены, связанные с разложением растений, для процветания в естественной среде, но сохранил эти геномные особенности после того, как был культивирован E. chinensis как грибная культура. Дальнейшая работа по сравнению как экспрессии генов, так и производства соединений между изолятами P. herquei из мицетангия E. chinensis и свободноживущими аналогами необходима для дальнейшего выяснения того, как этот гриб адаптировался к своему образу жизни и экологическим нишам в E. chinensis.

Три вида Penicillium, исследованные в этом исследовании, показывают сходный метаболический и ферментативный потенциал; кроме того, сообщалось, что виды Penicillium образуют симбиотические отношения по выращиванию грибов с двумя другими листосворачивающими долгоносиками Euops — Euops lespedezae (Kobayashi et al., 2008) и Euops splendida (Sakurai, 1985). Penicillium являются одним из наиболее химически изобретательных родов и хорошо известны своей способностью производить широкий спектр вторичных метаболитов и малых молекул, которые функционируют как антибиотики, токсины и пигменты (Nielsen et al., 2017). Самым известным представителем рода является Penicillium chrysogenum из-за его роли в производстве пенициллина и как загрязнителя помещений, пищевых продуктов и кормов (van den Berg et al., 2008). Penicillium decumbens широко используется в биопереработке из-за высокого производства целлюлазы и гемицеллюлазы (Liu et al., 2013). Большой ферментативный потенциал и потенциал вторичных метаболитов грибов Penicillium (Nielsen et al., 2017) согласуется с их широким распространением в природных экосистемах (Yadav et al., 2018), а также делает их идеальными кандидатами в культивары, которые могут привлекаться насекомыми, выращивающими грибы.

Симбиотическая система Euops—Penicillium имеет сходные черты с известными насекомыми, выращивающими грибы: все они полагаются на грибы в производстве большинства ферментов, разрушающих биомассу растений. Геномный анализ Leucoagaricus gongylophorus, базидиомицетного гриба, служащего источником пищи для муравьев, выращивающих грибы, подтвердил наличие генов, предположительно кодирующих ферменты, разрушающие биомассу, для переваривания целлюлозы, ксилана и других полимеров растений (Schiøtt et al., 2008); внеклеточные целлюлазы L. gongylophorus включают GH6, GH7, GH15 и CE5 (Aylward et al., 2013). Термиты, выращивающие грибы, в основном снабжают свои грибные культуры разлагающимся растительным материалом; грибы Termitomyces и бактерии в садах отвечают за деградацию лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы (Hyodo et al., 2003). Амброзиевые грибы, по-видимому, преимущественно разлагают гемицеллюлозу и другие простые сахара (De Fine Licht and Biedermann, 2012). Использование микробных симбионтов для доступа к растительным полисахаридам, по-видимому, также характерно для некоторых несоциальных насекомых, выращивающих грибы, таких как евразийский древесный пилильщик Sirex noctilio (F.) (Fu et al., 2020).

Молекулы-транспортеры являются интегральными мембранными белками, которые облегчают перемещение макромолекул, ионов или малых молекул через биологическую мембрану (Perlin et al., 2014). Транспортеры MFS и ABC являются двумя крупнейшими семействами грибных транспортеров, которые опосредуют транспорт интермедиатов и токсичных молекул в пути вторичного метаболизма (Perlin et al., 2014). В нашем исследовании, хотя лишь несколько белков ABC и MFS из трех видов грибов были функционально охарактеризованы, мы обнаружили, что P. herquei имел больше белков ABC и MFS, чем два других вида Penicillium. Напротив, Fu et al. (2020) обнаружили, что Amylostereum areolatum (Fr.) Boidin, грибной симбионт S. noctilio, имел мало белков ABC по сравнению со свободноживущими грибами, возможно, потому что A. areolatum в основном переносится своими насекомыми-хозяевами. Напротив, хотя P. herquei также переносится в специальном мицетангии самками долгоносиков E. chinensis перед использованием для инокуляции листовых свертков, он также является свободноживущим после инокуляции на листовые свертки (Wang et al., 2015). Более того, листовой сверток отрезается от растения самкой долгоносика и падает на почву, где постепенно разлагается во влажной среде (Li et al., 2012). Таким образом, P. herquei на листовом свертке имеет относительно длительную сапрофитную фазу в своем жизненном цикле, и поэтому он развил сильную способность транспортировать и выводить промежуточные и токсичные субстраты листовых свертков.

Поддержание монокультурного грибного культивара без присутствия других грибов требует высокоэффективных защитных функций в системах выращивания грибов (Schmidt et al., 2022). Производство токсичных вторичных метаболитов грибными симбионтами может обеспечивать защиту их хозяев (Clay, 2014). Penicillium herquei может производить широкий спектр биологически активных вторичных метаболитов, включая антибиотические феналеноны, норгеркеинон и геркеинон, алкалоиды и некоторые производные триенов (Tansakul et al., 2014), которые показали значительную противогрибковую и противогриппозную активность (Zhou et al., 2019). Мы показали, что P. herquei может подавлять рост двух патогенных видов Rhizopus, часто выделяемых из листовых свертков (Li et al., 2012). Wang et al. (2015) также обнаружили, что P. herquei производит антибиотик (+)-склеродеролид, который может защищать листовой сверток от потенциальной инфекции. В соответствии с этим, наше исследование показало, что геном P. herquei включает гены, продуцирующие соединения PKS, NRPS, T1PKS, а также гены биосинтеза терпеноидов, которые, вероятно, функционируют во вторичном метаболизме и могут помогать хозяину защищаться от токсинов и паразитов. PKS и NRPS, как известно, являются соединениями, продуцируемыми симбионтами, которые функционируют в защите некоторых насекомых и морских беспозвоночных (Piel, 2002). Penicillium herquei обладает большим числом генов биосинтеза вторичных метаболитов, которые могут оказывать антагонистическое действие на патогены и паразиты, встречающиеся как в листовых свертках, так и у насекомого-хозяина. Примечательно, что мы обнаружили, что P. herquei имеет значительно больше генов биосинтеза терпеноидов, чем два других изученных вида Penicillium. Терпеноиды являются самой большой и разнообразной группой вторичных метаболитов, превосходящей фенолы, флавоноиды и алкалоиды (Boncan et al., 2020). Терпеноиды опосредуют различные антагонистические и полезные взаимодействия между организмами (Gershenzon and Dudareva, 2007) и используются многими видами растений, животных и микроорганизмов для защиты от хищников, патогенов или конкурентов (Boncan et al., 2020). Наличие большего количества генов биосинтеза терпеноидов у P. herquei может способствовать более высокому накоплению терпенов в P. herquei, что приводит к улучшению защиты листовых свертков и личинок E. chinensis.

Взаимодействия патоген-насекомое необходимы для стимуляции иммунных реакций насекомых и индукции экспрессии факторов вирулентности грибными патогенами (Noman et al., 2021). Многие исследования показали, что гены, опосредующие взаимодействия патоген-растение в сигнальных путях, являются критическими для патогенности грибов (Shang et al., 2016). Сокращение генов PHI в геноме P. herquei предполагает, что отбор на поддержание генов вирулентности был ослаблен, вероятно, из-за его симбиотической ассоциации с E. chinensis, и споры гриба переносятся в специальном мицетангии на самках долгоносиков. Самки долгоносиков защищают гриб перед использованием его для инокуляции листовых свертков личинок. Более того, P. herquei служит важным питательным ресурсом для личинок E. chinensis (Wang et al., 2010; Li et al., 2012). В этом исследовании мы обнаружили лишь несколько генов, ассоциированных с вирулентностью (связанных с повышенной вирулентностью и летальными генами), в геноме P. herquei, и инактивация или снижение экспрессии этих генов может уменьшить или устранить патогенность этого гриба как для взрослых особей, так и для личинок E. chinensis. Аналогично, отсутствие экспрессии или низкая экспрессия летальных генов также наблюдается в геноме симбионта евразийского древесного пилильщика S. noctilio (Fu et al., 2020).

Геном P. herquei содержит разнообразный набор генов, ассоциированных с ферментами, активными в отношении углеводов, деградацией целлюлозы и гемицеллюлозы, транспортерами и биосинтезом терпеноидов. Сравнительная геномика показывает, что три вида Penicillium обладают сходным метаболическим и ферментативным потенциалом, однако P. herquei имеет больше генов, связанных с деградацией растительной биомассы и защитой, но меньше генов, ассоциированных с вирулентностью и патогенностью. В совокупности наши результаты предоставляют молекулярные доказательства деградации растительного субстрата и защитных ролей P. herquei в его хозяине E. chinensis. Большой ферментативный потенциал и потенциал вторичных метаболитов, общие для представителей рода Penicillium, вероятно, являются важным свойством, благодаря которому некоторые грибы Penicillium привлекаются долгоносиками Euops, выращивающими грибы, в качестве грибных культур.

Дополнительные материалы к этой статье можно найти онлайн по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1048910/full#supplementary-material

1. ^https://github.com/BGI-flexlab/SOAPnuke

2. ^https://github.com/xiaochuanle/NECAT

3. ^http://www.repeatmasker.org

4. ^https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/nonredundantproteins/

5. ^http://darwin.uvigo.es/software/modeltest.html

6. ^http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/

7. ^http://www.phi-base.org/

Ссылки

1. Aanen D. K. (2006). As you reap, so shall you sow: coupling of harvesting and inoculating stabilizes the mutualism between termites and fungi. Biol. Lett. 2, 209–212. doi: 10.1146/annurev-ento-011019-024910. CrossRef. Google Scholar.

2. Aylward F. O., Burnum-Johnson K. E., Tringe S. G., Teiling C., Tremmel D. M., Moeller J. A., et al. (2013). Leucoagaricus gongylophorus produces diverse enzymes for the degradation of recalcitrant plant polymers in leaf-cutter ant fungus gardens. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3770–3778. doi: 10.1128/AEM.03833-12. CrossRef. Google Scholar.

3. Bairoch A., Apweiler R., Wu C. H., Barker W. C., Boeckmann B., Ferro S., et al. (2005). The universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 33, D154–D159. doi: 10.1093/nar/gki070. CrossRef. Google Scholar.

4. Bao W. D., Kojima K. K., Kohany O. (2015). Repbase update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mob. DNA 6:11. doi: 10.1186/s13100-015-0041-9. CrossRef. Google Scholar.

5. Biedermann P. H., Vega F. E. (2020). Ecology and evolution of insect-fungus mutualisms. Annu. Rev. Entomol. 65, 431–455. doi: 10.1146/annurev-ento-011019-024910. CrossRef. Google Scholar.

6. Blin K., Shaw S., Kloosterman A. M., Charlop-Powers Z., Van Wezel G. P., Medema M. H., et al. (2021). antiSMASH 6.0: improving cluster detection and comparison capabilities. Nucleic Acids Res. 49, W29–W35. doi: 10.1093/nar/gkab335. CrossRef. Google Scholar.

7. Boncan D. A. T., Tsang S. S. K., Li C., Lee I. H. T., Lam H. M., Chan T. F., et al. (2020). Terpenes and terpenoids in plants: interactions with environment and insects. Int. J. Mol. Sci. 21:7382. doi: 10.3390/ijms21197382. CrossRef. Google Scholar.

8. Calderón-Cortés N., Quesada M., Watanabe H., Cano-Camacho H., Oyama K. (2012). Endogenous plant cell wall digestion: a key mechanism in insect evolution. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 43, 45–71. doi: 10.1146/annurev-ecolsys-110411-160312. CrossRef. Google Scholar.

9. Capella-Gutiérrez S., Silla-Martínez J. M., Gabaldón T. (2009). trimAl: a tool for automated alignment trimming in large-scale phylogenetic analyses. Bioinformatics 25, 1972–1973. doi: 10.1093/bioinformatics/btp348. CrossRef. Google Scholar.

10. Clay K. (2014). Defensive symbiosis: a microbial perspective. Funct. Ecol. 28, 293–298. doi: 10.1111/1365-2435.12258. CrossRef. Google Scholar.

11. da Costa R. R., Vreeburg S. M., Shik J. Z., Aanen D. K., Poulsen M. (2019). Can interaction specificity in the fungus-farming termite symbiosis be explained by nutritional requirements of the fungal crop? Fungal Ecol. 38, 54–61. doi: 10.1016/j.funeco.2018.08.009. CrossRef. Google Scholar.

12. De Bie T., Cristianini N., Demuth J. P., Hahn M. W. (2006). CAFE: a computational tool for the study of gene family evolution. Bioinformatics 22, 1269–1271. doi: 10.1093/bioinformatics/btl097. CrossRef. Google Scholar.

13. De Fine Licht H. H., Biedermann P. H. (2012). Patterns of functional enzyme activity in fungus farming ambrosia beetles. Front. Zool. 9:13. doi: 10.1186/1742-9994-9-13. CrossRef. Google Scholar.

14. Drummond A. J., Rambaut A. (2007). BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees. BMC Evol. Biol. 7:214. doi: 10.1186/1471-2148-7-214. CrossRef. Google Scholar.

15. Edgar R. C. (2004). MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, 1792–1797. doi: 10.1093/nar/gkh340. CrossRef. Google Scholar.

16. Emms D. M., Kelly S. (2019). OrthoFinder: phylogenetic orthology inference for comparative genomics. Genome Biol. 20:238. doi: 10.1186/s13059-019-1832-y. CrossRef. Google Scholar.

17. Enright A. J., Van Dongen S., Ouzounis C. A. (2002). An efficient algorithm for large-scale detection of protein families. Nucleic Acids Res. 30, 1575–1584. doi: 10.1093/nar/30.7.1575. CrossRef. Google Scholar.

18. Fan H., Noda H., Xie H., Suetsugu Y., Zhu Q., Zhang C. (2015). Genomic analysis of an ascomycete fungus from the rice planthopper reveals how it adapts to an endosymbiotic lifestyle. Genome Biol. Evol. 7, 2623–2634. doi: 10.1093/gbe/evv169. CrossRef. Google Scholar.

19. Fawal N., Li Q., Savelli B., Brette M., Passaia G., Fabre M., et al. (2012). PeroxiBase: a database for large-scale evolutionary analysis of peroxidases. Nucleic Acids Res. 41, D441–D444. doi: 10.1093/nar/gks1083. CrossRef. Google Scholar.

20. Finn R. D., Clements J., Eddy S. R. (2011). HMMER web server: interactive sequence similarity searching. Nucleic Acids Res. 39, W29–W37. doi: 10.1093/nar/gkr367. CrossRef. Google Scholar.

21. Francke-Grosmann H. (1967). "Ectosymbiosis in wood-inhabiting insects" in Symbiosis. ed. Henry S. M. (New York and London: Academic Press), 141–203. Google Scholar.

22. Fu N., Wang M., Wang L., Luo Y., Ren L. (2020). Genome sequencing and analysis of the fungal symbiont of Sirex noctilio, Amylostereum areolatum: revealing the biology of fungus-insect mutualism. mSphere 5, e00301–e00320. doi: 10.1128/mSphere.00301-20. CrossRef. Google Scholar.

23. Gardner P. P., Daub J., Tate J. G., Nawrocki E. P., Kolbe D. L., Lindgreen S., et al. (2009). Rfam: updates to the RNA families database. Nucleic Acids Res. 37, D136–D140. doi: 10.1093/nar/gkn766. CrossRef. Google Scholar.

24. Gene Ontology Consortium (2004). The gene ontology (GO) database and informatics resource. Nucleic Acids Res. 32, 258D–2261D. doi: 10.1093/nar/gkh036. CrossRef. Google Scholar.

25. Gershenzon J., Dudareva N. (2007). The function of terpene natural products in the natural world. Nat. Chem. Biol. 3, 408–414. doi: 10.1038/nchembio.2007.5. CrossRef. Google Scholar.

26. Goes A. C., Barcoto M. O., Kooij P. W., Bueno O. C., Rodrigues A. (2020). How do leaf-cutting ants recognize antagonistic microbes in their fungal crops? Front Eco Evol 8:95. doi: 10.3389/fevo.2020.00095. CrossRef. Google Scholar.

27. Gohli J., Kirkendall L. R., Smith S. M., Cognato A. I., Hulcr J., Jordal B. H. (2017). Biological factors contributing to bark and ambrosia beetle species diversification. Evolution 71, 1258–1272. doi: 10.1111/evo.13219. CrossRef. Google Scholar.

28. Grebennikov V. V., Leschen R. A. B. (2010). External exoskeletal cavities in Coleoptera and their possible mycangial functions. Entomol Sci 13, 81–98. doi: 10.1111/j.1479-8298.2009.00351.x. CrossRef. Google Scholar.

29. Hage H., Rosso M. N. (2021). Evolution of fungal carbohydrate-active enzyme portfolios and adaptation to plant cell-wall polymers. J Fungi 7:185. doi: 10.3390/jof7030185. CrossRef. Google Scholar.

30. Haridas S., Wang Y., Lim L., Massoumi Alamouti S., Jackman S., Docking R., et al. (2013). The genome and transcriptome of the pine saprophyte Ophiostoma piceae, and a comparison with the bark beetle-associated pine pathogen Grosmannia clavigera. BMC Genomics 14, 1–15. doi: 10.1186/1471-2164-14-373. CrossRef. Google Scholar.

31. Hata H., Kato M. (2006). A novel obligate cultivation mutualism between damselfish and Polysiphonia algae. Biol. Lett. 2, 593–596. doi: 10.1098/rsbl.2006.0528. CrossRef. Google Scholar.

32. Houbraken J., Samson R. (2011). Phylogeny of Penicillium and the segregation of Trichocomaceae into three families. Stud. Mycol. 70, 1–51. doi: 10.3114/sim.2011.70.01. CrossRef. Google Scholar.

33. Huang Y. T., Skelton J., Hulcr J. (2019). Multiple evolutionary origins lead to diversity in the metabolic profiles of ambrosia fungi. Fungal Ecol. 38, 80–88. doi: 10.1016/j.funeco.2018.03.006. CrossRef. Google Scholar.

34. Hyodo F., Tayasu I., Inoue T., Azuma J. I., Kudo T., Abe T. (2003). Differential role of symbiotic fungi in lignin degradation and food provision for fungus-growing termites (Macrotermitinae: Isoptera). Funct. Ecol. 17, 186–193. doi: 10.1046/j.1365-2435.2003.00718.x. CrossRef. Google Scholar.

35. Johnson A. D., Handsaker R. E., Pulit S. L., Nizzari M. M., O'Donnell C. J., De Bakker P. I. (2008). SNAP: a web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics 24, 2938–2939. doi: 10.1093/bioinformatics/btn564. CrossRef. Google Scholar.

36. Johnson M., Zaretskaya I., Raytselis Y., Merezhuk Y., McGinnis S., Madden T. L. (2008). NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Res. 36, W5–W9. doi: 10.1093/nar/gkn201. CrossRef. Google Scholar.

37. Kanehisa M., Goto S. (2000). KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28, 27–30. doi: 10.1093/nar/28.1.27. CrossRef. Google Scholar.

38. Kirkendall L. R., Biedermann P. H., Jordal B. H. (2015). "Evolution and diversity of bark and ambrosia beetles" in Bark Beetles. eds. Vega F. E., Hofstetter R. (New York: Academic Elsevier), 85–156. Google Scholar.

39. Knowles J., Lehtovaara P., Teeri T. (1987). Cellulase families and their genes. Trends Biotechnol. 5, 255–261. doi: 10.1016/0167-7799(87)90102-8. CrossRef. Google Scholar.

40. Kobayashi C., Fukasawa Y., Hirose D., Kato M. (2008). Contribution of symbiotic mycangial fungi to larval nutrition of a leaf-rolling weevil. Evol. Ecol. 22, 711–722. doi: 10.1007/s10682-007-9196-2. CrossRef. Google Scholar.

41. Kooij P. W., Pellicer J. (2020). Genome size versus genome assemblies: are the genomes truly expanded in polyploid fungal symbionts? Genome Biol. Evol. 12, 2384–2390. doi: 10.1093/gbe/evaa217. CrossRef. Google Scholar.

42. Kubicek C. P., Starr T. L., Glass N. L. (2014). Plant cell wall-degrading enzymes and their secretion in plant-pathogenic fungi. Annu. Rev. Phytopathol. 52, 427–451. doi: 10.1146/annurev-phyto-102313-045831. CrossRef. Google Scholar.

43. Lagesen K., Hallin P., Rødland E. A., Stærfeldt H. H., Rognes T., Ussery D. W. (2007). RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes. Nucleic Acids Res. 35, 3100–3108. doi: 10.1093/nar/gkm160. CrossRef. Google Scholar.

44. Li X. Q., Guo W. F., Ding J. Q. (2012). Mycangial fungus benefits the development of a leaf-rolling weevil, Euops chinesis. J. Insect Physiol. 58, 867–873. doi: 10.1016/j.jinsphys.2012.03.011. CrossRef. Google Scholar.

45. Li X. Q., Guo W. F., Wen Y. G., Solanki M. K., Ding J. Q. (2016). Transmission of symbiotic fungus with a nonsocial leaf-rolling weevil. J. Asia Pac. Entomol. 19, 619–624. doi: 10.1016/j.aspen.2016.06.006. CrossRef. Google Scholar.

46. Liu G., Zhang L., Wei X., Zou G., Qin Y., Ma L., et al. (2013). Genomic and secretomic analyses reveal unique features of the lignocellulolytic enzyme system of Penicillium decumbens. PLoS One 8:e55185. doi: 10.1371/journal.pone.0055185. CrossRef. Google Scholar.

47. Lombard V., Golaconda Ramulu H., Drula E., Coutinho P. M., Henrissat B. (2014). The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42, D490–D495. doi: 10.1093/nar/gkt1178. CrossRef. Google Scholar.

48. Mayers C. G., Harrington T. C., Biedermann P. H. W. (2022). "Mycangia define the diverse ambrosia beetle-fungus symbioses" in The Convergent Evolution of Agriculture in Humans and Insects. eds. Schultz T. R., Gawne R., Peregrine P. N. (Cambridge: The MIT Press), 1–38. Google Scholar.

49. McArthur A. G., Waglechner N., Nizam F., Yan A., Azad M. A., Baylay A. J., et al. (2013). The comprehensive antibiotic resistance database. Antimicrob Agents Ch 57, 3348–3357. doi: 10.1128/AAC.00419-13. CrossRef. Google Scholar.

50. Mueller U. G., Kardish M. R., Ishak H. D., Wright A. M., Solomon S. E., Bruschi S. M., et al. (2018). Phylogenetic patterns of ant-fungus associations indicate that farming strategies, not only a superior fungal cultivar, explain the ecological success of leafcutter ants. Mol. Ecol. 27, 2414–2434. doi: 10.1111/mec.14588. CrossRef. Google Scholar.

51. Mueller U. G., Schultz T. R., Currie C. R., Adams R. M., Malloch D. (2001). The origin of the attine ant-fungus mutualism. Q. Rev. Biol. 76, 169–197. doi: 10.1086/393867. CrossRef. Google Scholar.

52. Nielsen J. C., Grijseels S., Prigent S., Ji B., Dainat J., Nielsen K. F., et al. (2017). Global analysis of biosynthetic gene clusters reveals vast potential of secondary metabolite production in Penicillium species. Nat. Microbiol. 2:17044. doi: 10.1038/nmicrobiol.2017.44. CrossRef. Google Scholar.

53. Noman A., Aqeel M., Islam W., Khalid N., Akhtar N., Qasim M., et al. (2021). Insects-plants-pathogens: toxicity, dependence and defense dynamics. Toxicon 197, 87–98. doi: 10.1016/j.toxicon.2021.04.004. CrossRef. Google Scholar.

54. Nygaard S., Hu H., Li C., Schiøtt M., Chen Z., Yang Z., et al. (2016). Reciprocal genomic evolution in the ant-fungus agricultural symbiosis. Nat. Commun. 7:12233. doi: 10.1038/ncomms12233. CrossRef. Google Scholar.

55. Nygaard S., Zhang G., Schiøtt M., Li C., Wurm Y., Hu H., et al. (2011). The genome of the leaf-cutting ant Acromyrmex echinatior suggests key adaptations to advanced social life and fungus farming. Genome Res. 21, 1339–1348. doi: 10.1101/gr.121392.111. CrossRef. Google Scholar.

56. Pathak A., Kett S., Marvasi M. (2019). Resisting antimicrobial resistance: lessons from fungus farming ants. Trends Ecol. Evol. 34, 974–976. doi: 10.1016/j.tree.2019.08.007. CrossRef. Google Scholar.

57. Pereira R. A. S., Kjellberg F. (2021). "Mutualism as a source of evolutionary innovation: insights from insect-plant interactions" in Plant-Animal Interactions. eds. Del-Claro K., Torezan-Silingardi H. (Cham: Springer), 307–332. Google Scholar.

58. Perlin M. H., Andrews J., San Toh S. (2014). Essential letters in the fungal alphabet: ABC and MFS transporters and their roles in survival and pathogenicity. Adv. Genet. 85, 201–253. doi: 10.1016/B978-0-12-800271-1.00004-4. CrossRef. Google Scholar.

59. Piel J. (2002). A polyketide synthase-peptide synthetase gene cluster from an uncultured bacterial symbiont of Paederus beetles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 14002–14007. doi: 10.1073/pnas.222481399. CrossRef. Google Scholar.

60. Porebski S., Bailey L. G., Baum B. R. (1997). Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol Biol Peporter 15, 8–15. doi: 10.1007/BF02772108. CrossRef. Google Scholar.

61. Poulsen M., Hu H., Li C., Chen Z., Xu L., Otani S., et al. (2014). Complementary symbiont contributions to plant decomposition in a fungus-farming termite. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 14500–14505. doi: 10.1073/pnas.131971811. CrossRef. Google Scholar.

62. Roach M. J., Schmidt S. A., Borneman A. R. (2018). Purge Haplotigs: allelic contig reassignment for third-gen diploid genome assemblies. BMC Bioinformatics 19:460. doi: 10.1186/s12859-018-2485-7. CrossRef. Google Scholar.

63. Saier J., Milton H., Reddy V. S., Tamang D. G., Västermark Å. (2014). The transporter classification database. Nucleic Acids Res. 42, D251–D258. doi: 10.1093/nar/gkt1097. CrossRef. Google Scholar.

64. Sakurai K. (1985). An attelabid weevil (Euops splendida) cultivates fungi. J. Ethol. 3, 151–156. doi: 10.1007/BF02350306. CrossRef. Google Scholar.

65. Sammond D. W., Payne C. M., Brunecky R., Himmel M. E., Crowley M. F., Beckham G. T. (2012). Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One 7:e48615. doi: 10.1371/journal.pone.0048615. CrossRef. Google Scholar.

66. Santos S. A., Vidigal P. M., Thrimawithana A., Betancourth B. M., Guimarães L. M., Templeton M. D., et al. (2020). Comparative genomic and transcriptomic analyses reveal different pathogenicity-related genes among three eucalyptus fungal pathogens. Fungal Genet. Biol. 137:103332. doi: 10.1016/j.fgb.2019.103332. CrossRef. Google Scholar.

67. Sawada Y., Morimoto K. (1986). The mycetangia and the mode of the fungus transmission in the weevil genus Euops (Coleoptera: Attelabidae). Sci Bull Fac Agric Kyushu Univ 40, 197–205. Google Scholar.

68. Schiøtt M., De Fine Licht H. H., Lange L., Boomsma J. J. (2008). Towards a molecular understanding of symbiont function: identification of a fungal gene for the degradation of xylan in the fungus gardens of leaf-cutting ants. BMC Microbiol. 8, 1–10. doi: 10.1186/1471-2180-8-40. CrossRef. Google Scholar.

69. Schmidt S., Kildgaard S., Guo H., Beemelmanns C., Poulsen M. (2022). The chemical ecology of the fungus-farming termite symbiosis. Nat. Prod. Rep. 39, 231–248. doi: 10.1039/D1NP00022E. CrossRef. Google Scholar.

70. Shang Y., Xiao G., Zheng P., Cen K., Zhan S., Wang C. (2016). Divergent and convergent evolution of fungal pathogenicity. Genome Biol. Evol. 8, 1374–1387. doi: 10.1093/gbe/evw082. CrossRef. Google Scholar.

71. Silliman B. R., Newell S. Y. (2003). Fungal farming in a snail. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15643–15648. doi: 10.1073/pnas.2535227100. CrossRef. Google Scholar.

72. Six D. L. (2020). Niche construction theory can link bark beetle-fungus symbiosis type and colonization behavior to large scale causal chain-effects. Curr Opin Insect Sci 39, 27–34. doi: 10.1016/j.cois.2019.12.005. CrossRef. Google Scholar.

73. Skelton J., Johnson A. J., Jusino M. A., Bateman C. C., Li Y., Hulcr J. (2019). A selective fungal transport organ (mycangium) maintains coarse phylogenetic congruence between fungus-farming ambrosia beetles and their symbionts. Proc Royal Soc B 286:20182127. doi: 10.1098/rspb.2018.2127. CrossRef. Google Scholar.

74. Solomon S. E., Rabeling C., Sosa-Calvo J., Lopes C. T., Rodrigues A., Vasconcelos H. L., et al. (2019). The molecular phylogenetics of Trachymyrmex Forel ants and their fungal cultivars provide insights into the origin and coevolutionary history of 'higher-attine'ant agriculture. Syst. Entomol. 44, 939–956. doi: 10.1111/syen.12370. CrossRef. Google Scholar.

75. Stamatakis A. (2014). RAxML version 8: a tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies. Bioinformatics 30, 1312–1313. doi: 10.1093/bioinformatics/btu033. CrossRef. Google Scholar.

76. Stanke M., Keller O., Gunduz I., Hayes A., Waack S., Morgenstern B. (2006). AUGUSTUS: ab initio prediction of alternative transcripts. Nucleic Acids Res. 34, W435–W439. doi: 10.1093/nar/gkl200. CrossRef. Google Scholar.

77. Tansakul C., Rukachaisirikul V., Maha A., Kongprapan T., Phongpaichit S., Hutadilok-Towatana N., et al. (2014). A new phenalenone derivative from the soil fungus Penicillium herquei PSU-RSPG93. Nat. Prod. Res. 28, 1718–1724. doi: 10.1080/14786419.2014.941363. CrossRef. Google Scholar.

78. Tatusov R. L., Fedorova N. D., Jackson J. D., Jacobs A. R., Kiryutin B., Koonin E. V., et al. (2003). The COG database: an updated version includes eukaryotes. BMC Bioinformatics 4:41. doi: 10.1186/1471-2105-4-41. CrossRef. Google Scholar.

79. Ter-Hovhannisyan V., Lomsadze A., Chernoff Y. O., Borodovsky M. (2008). Gene prediction in novel fungal genomes using an ab initio algorithm with unsupervised training. Genome Res. 18, 1979–1990. doi: 10.1101/gr.081612.108. CrossRef. Google Scholar.

80. Toki W., Tanahashi M., Togashi K., Fukatsu T. (2012). Fungal farming in a non-social beetle. PLoS One 7:e41893. doi: 10.1371/journal.pone.0041893. CrossRef. Google Scholar.

81. Tokuda G. (2019). Plant cell wall degradation in insects: recent progress on endogenous enzymes revealed by multi-omics technologies. Adv Insect Physiol 57, 97–136. doi: 10.1016/bs.aiip.2019.08.001. CrossRef. Google Scholar.

82. van den Berg M. A., Albang R., Albermann K., Badger J. H., Daran J. M., Driessen M., et al. (2008). Genome sequencing and analysis of the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. Nat. Biotechnol. 26, 1161–1168. doi: 10.1038/nbt.1498. CrossRef. Google Scholar.

83. Vanderpool D., Bracewell R. R., McCutcheon J. P. (2018). Know your farmer: ancient origins and multiple independent domestications of ambrosia beetle fungal cultivars. Mol. Ecol. 27, 2077–2094. doi: 10.1111/mec.14394. CrossRef. Google Scholar.

84. Vaser R., Sović I., Nagarajan N., Šikić M. (2017). Fast and accurate de novo genome assembly from long uncorrected reads. Genome Res. 27, 737–746. doi: 10.1101/gr.214270.116. CrossRef. Google Scholar.

85. Walker B. J., Abeel T., Shea T., Priest M., Abouelliel A., Sakthikumar S., et al. (2014). Pilon: an integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement. PLoS One 9:e112963. doi: 10.1371/journal.pone.0112963. CrossRef. Google Scholar.

86. Wang L., Feng Y., Tian J., Xiang M., Sun J., Ding J., et al. (2015). Farming of a defensive fungal mutualist by an attelabid weevil. ISME J. 9, 1793–1801. doi: 10.1038/ismej.2014.263. CrossRef. Google Scholar.

87. Wang Y. Z., Wu K., Ding J. Q. (2010). Host specificity of Euops chinesis, a potential biological control agent of Fallopia japonica, an invasive plant in Europe and North America. BioControl 55, 551–559. doi: 10.1007/s10526-010-9279-9. CrossRef. Google Scholar.

88. Waterhouse R. M., Seppey M., Simão F. A., Manni M., Ioannidis P., Klioutchnikov G., et al. (2018). BUSCO applications from quality assessments to gene prediction and phylogenomics. Mol. Biol. Evol. 35, 543–548. doi: 10.1093/molbev/msx319. CrossRef. Google Scholar.

89. Wilken P. M., Aylward J., Chand R., Grewe F., Lane F. A., Sinha S., et al. (2020). IMA genome-F13: Draft genome sequences of Ambrosiella cleistominuta,Cercospora brassicicola, C.citrullina, Physcia stellaris, and Teratosphaeria pseudoeucalypti. IMA Fungus 11, 19–17. doi: 10.1186/s43008-020-00039-7. CrossRef. Google Scholar.

90. Wyman C. E., Decker S. R., Himmel M. E., Brady J. W., Skopec C. E., Viikari L. (2005). "Hydrolysis of cellulose and hemicellulose" in Polysaccharides: Structural Diversity and Functional Versatility. ed. Dumitriu S. (New York: Marcel Dekker, Inc), 1023–1062. Google Scholar.

91. Yadav A. N., Verma P., Kumar V., Sangwan P., Mishra S., Panjiar N., et al. (2018). "Biodiversity of the genus Penicillium in different habitats" in New and Future Developments in Microbial Biotechnology and Bioengineering. eds. Gupta V., Rodriguez-Couto S. (Amsterdam: Elsevier), 3–18. Google Scholar.

92. Yang Z. H., Rannala B. (2006). Bayesian estimation of species divergence times under a molecular clock using multiple fossil calibrations with soft bounds. Mol. Biol. Evol. 23, 212–226. doi: 10.1093/molbev/msj024. CrossRef. Google Scholar.

93. Yang H., Yan R., Chen H., Lee D. H., Zheng C. (2007). Characteristics of hemicellulose, cellulose and lignin pyrolysis. Fuel 86, 1781–1788. doi: 10.1016/j.fuel.2006.12.013. CrossRef. Google Scholar.

94. Zhou X. M., Zheng C. J., Song X. M., Tang M. M., Yang J. Y., Yang X., et al. (2019). Bioactive acetaminophen derivatives from Penicillum herquei JX4. Fitoterapia 139:104400. doi: 10.1016/j.fitote.2019.104400. CrossRef. Google Scholar.

Guo W, Wang W, Tang J, Li T and Li X (2023) Genome analysis and genomic comparison of a fungal cultivar of the nonsocial weevil Euops chinensis reveals its plant decomposition and protective roles in fungus-farming mutualism. Front. Microbiol. 14:1048910. doi: 10.3389/fmicb.2023.1048910

Перевод статьи «Genome analysis and genomic comparison of a fungal cultivar of the nonsocial weevilEuops chinensisreveals its plant decomposition and protective roles in fungus-farming mutualism» авторов Guo W, Wang W, Tang J, Li T and Li X., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык