Иммунная ловушка: как Piscirickettsia salmonis обманывает защиту лосося и почему вакцины не работают

Пискириггетсиоз (SRS) является важнейшим инфекционным заболеванием в чилийском лососеводстве с 1980-х годов. Это одно из первых описанных заболеваний, и на сегодняшний день оно продолжает оставаться основной инфекционной причиной смертности. Как же лучше понять эпидемиологическую ситуацию с SRS? Универсальный ответ заключается в том, что чилийская лососеводческая отрасль вынуждена из года в год бороться с многофакторным заболеванием, и, по-видимому, только среда в Чили благоприятствует присутствию и сохранению Piscirickettsia salmonis.

Это капризная, факультативно внутриклеточная бактерия, которая реплицируется в собственных иммунных клетках хозяина и антигенпрезентирующих клетках, уклоняясь от адаптивного клеточно-опосредованного иммунного ответа, именно поэтому существующие вакцины неэффективны для её контроля. Следовательно, чилийская лососеводческая отрасль использует большое количество антибиотиков для борьбы с SRS, поскольку в противном случае здоровье и благополучие рыбы были бы значительно нарушены, а ежегодные потери биомассы были бы существенно выше. Как сбалансировать постоянный риск негативных последствий применения антибиотиков в лососеводстве с производственной и экономической жизнеспособностью животноводческой отрасли, а также с заботой о водной среде, общественном здоровье и устойчивости самой отрасли? Ответ, который прост, но от этого не менее верен: мы должны знать врага и то, как он взаимодействует со своим хозяином. В рамках этого направления получено много знаний, однако их всё ещё недостаточно. Учитывая современное состояние дел, обобщённое в данном обзоре, можно утверждать, что с точки зрения иммунологии рыб и вакцинологии мы довольно далеки от достижения эффективного и долгосрочного решения для контроля SRS. По этой причине целью данного критического обзора является всестороннее обсуждение современных знаний о взаимодействии между бактерией и хозяином для стимулирования разработки более совершенных и многочисленных мер профилактики и контроля SRS.

Пискириггетсиоз (SRS) вызывается грамотрицательной факультативно внутриклеточной бактерией Piscirickettsia salmonis, которая относится к подклассу гамма-протеобактерий вместе с родами Coxiella и Francisella (1). P. salmonis подтверждена в качестве возбудителя SRS у кижуча (Oncorhynchus kisutch), атлантического лосося (Salmo salar) и радужной форели (Oncorhynchus mykiss) в Норвегии, Канаде, Шотландии, Ирландии и Чили (1). Однако SRS особенно сильно поражает лососеводство в Чили. В 2020 году SRS был причиной 47,8% и 67,3% смертности, связанной с инфекционными заболеваниями, и 11,7% и 10,7% общей смертности при производстве атлантического лосося и радужной форели соответственно (2). Наиболее важными детерминантами распространенности SRS являются количество инфицированных ферм в верхних по течению водах, а также соленость и температура морской воды (3). На нижерасположенных фермах по отношению к инфицированным верхним фермам распространенность SRS на 25-й неделе цикла приближалась к 100%, в то время как на фермах с небольшим воздействием или без воздействия инфицированных верхних ферм распространенность достигала лишь ~10% на 56-й неделе. Аналогично, распространенность SRS в пределах группы концессий или «соседств» достигала 100% в среднем через 46 недель после периода парования (4).

В то же время мы наблюдали среднее сокращение объема противомикробных препаратов, используемых в чилийской лососевой промышленности, на 18,3% в период с 2016 по 2019 год, хотя в течение 2020 года наблюдалось небольшое увеличение на 7,6% по сравнению с 2019 годом (5). Это очень важно, поскольку в среднем 93,5% от общего объема противомикробных препаратов, использованных в период с 2017 по 2020 год, было использовано для борьбы с SRS. Эти результаты могут быть следствием положительного влияния стратегии здоровья для борьбы с SRS, основанной на специальной официальной программе эпидемиологического надзора, улучшенных планах генетической устойчивости, нормативных изменениях и надлежащих производственных практиках, включая аспекты благополучия животных, меньшую плотность посадки, периоды парования, вакцинацию и другие практики. Однако небольшое увеличение, наблюдавшееся в 2020 году, является индикатором раннего предупреждения, который был отмечен наряду с обнаружением P. salmonis, появлением более ранних клинических признаков SRS после пересадки смолтов в морскую воду и увеличением смертности, связанной с SRS, — все это индикаторы, которые подтверждают относительную эффективность коммерчески доступных вакцин для борьбы с болезнью.

P. salmonis проникает в рыбу главным образом через слизистые поверхности, такие как кожа и жабры, и в меньшей степени через кишечник (6–8). P. salmonis может даже проникать через неповрежденную кожу здоровой рыбы (7), и хотя P. salmonis не подвергается значительному отрицательному воздействию при контакте со слизью кожи радужной форели и атлантического лосося с течением времени, цитотоксический эффект бактерии, предварительно подвергнутой воздействию слизи кожи лососевых, замедляется (9). Розас-Серри и др. (8) впервые сообщили о модели заражения через совместное содержание для P. salmonis, которая была использована для сравнительного описания патогенеза SRS с использованием изолятов LF-89 и EM-90. Это исследование показало, что патогенез постсмолтов атлантического лосося, инфицированных изолятами P. salmonis, подобными LF-89 и EM-90, различался. Рыба, инфицированная EM-90, показала более высокую кумулятивную смертность и более короткое время до смерти, чем рыба, инфицированная LF-89. Изолят EM-90 вызывает острое системное и геморрагическое заболевание, характеризующееся поражениями всех внутренних органов, тогда как наиболее частые внутренние поражения у рыбы, инфицированной LF-89, показывают более классическую патологическую картину SRS со спленомегалией, реномегалией, крупными желтовато-белыми узелками в почках и печени, фибринозными псевдомембранами в печени и сердце, гидроперикардом и экхимозами в печени (Рисунок 1). При гистологическом исследовании желтовато-белые узелки оказались гранулемами, типично состоящими из центрального некроза с присутствием бактерий и окруженными макрофагами на разных стадиях, нейтрофилами, предположительно дендритными клетками (ДК) и естественными клетками-киллерами; наконец, все узелки окружены предположительно Т- и В-клетками (Рисунок 1). Однако детальная молекулярная и клеточная характеристика гранулемы, возникающей при острой и хронической инфекции P. salmonis, остается неполной, главным образом потому, что антитела для уверенной идентификации различных клеточных популяций не существуют или недоступны. P. salmonis индуцирует флагеллин-зависимую активацию tlr5, что приводит к повышению регуляции tnfa, il1b, il8 и il16 (10–13) и способствует интенсивному провоспалительному ответу, поддерживаемому активацией лейкоцитов и хемотаксисом нейтрофилов и макрофагов к месту инфекции. В то же время у рыбы, инфицированной P. salmonis, наблюдалась повышенная регуляция relb и пониженная регуляция nfkbiz, что определяет активацию пути NF-kB (10, 12), способствуя повышению регуляции генов, кодирующих белки острой фазы (lect2, ltbr4, gpr84 и gpr43), и хемокинов (cxcl7, cxcl9, cxcl10, cxcl12 и cxcr1) (10, 12, 13). Рыба из обеих групп показала изменения в различных биохимических параметрах крови, связанных с функцией печени и почек, хотя наиболее серьезные изменения были обнаружены у рыбы, инфицированной EM-90. Кроме того, присутствие P. salmonis было обнаружено в жабрах рыб, содержащихся совместно в обеих группах, через 21 день после инфекции, что подтверждает, что жабры являются основными воротами проникновения бактерии в хозяина. Более того, обнаружение бактерии в жабрах через 21 день после инфекции и возникновение первых смертей через 36 дней после инфекции у рыбы с EM-90 и через 40 дней после инфекции у рыбы с LF-89 может указывать на то, что эти изоляты имеют инкубационные периоды 15 и 20 дней соответственно.

Рисунок 1 Макроскопическая патология и микроскопические поражения в печени, связанные с инфекцией SRS. (A) Бледная печень с подкапсульными и округлыми красноватыми и серо-желтыми пятнистыми участками диаметром примерно 1-6 мм. Пунктирная красная линия обозначает границы серовато-белого дискретного узелка, характерного для инфекции P. salmonis. (B) Многоочаговый некроз гепатоцитов, диффузная инфильтрация воспалительными клетками и очаговая гранулема и/или многоочаговые сливающиеся гранулемы. Пунктирная красная линия обозначает границы очаговой гранулемы. Масштаб: 50 мкм. (C) Иммунолокализация внеклеточной P. salmonis в центральной зоне некротических поражений и внутриклеточной P. salmonis внутри макрофагов с использованием иммуногистохимии. Масштаб: 50 мкм. (D) Желтовато-белые узелки представляют собой гранулемы, типично состоящие из центрального некроза с присутствием бактерий, окруженные макрофагами на разных стадиях, нейтрофилами, предположительно дендритными клетками и естественными клетками-киллерами; все это окружено лимфоцитами (предположительно Т- и В-клетками).

Модели заражения через совместное содержание и погружение обычно считаются лучшей стратегией по сравнению с моделями заражения внутрибрюшинной инъекцией с точки зрения имитации естественной инфекции (8, 14, 15). Существуют лишь небольшие различия между моделями внутрибрюшинного и совместного заражения с учетом смертности и патологических изменений (8, 14, 15). Меза и др. (14) сообщили, что за инкубационным периодом последовала острая вспышка, причем смертность достигла 100% в обеих группах заражения. Напротив, Розас-Серри и др. (8) описали кумулятивную смертность 84% и 100% у рыбы, инфицированной внутрибрюшинно LF-89 и EM-90 соответственно, но у рыбы, инфицированной с использованием модели совместного заражения, кумулятивная смертность достигла 70 и 95%. В обоих исследованиях патологические и гистопатологические изменения были более заметны во время клинической фазы заболевания. Тем не менее, смерть рыбы в группе совместного содержания была зарегистрирована раньше в исследовании Мезы и др. (14), чем у Розас-Серри и др. (8) (28 дней после заражения против 36 дней после заражения соответственно), что может быть связано с экологическими переменными экспериментального дизайна; например, рыбу содержали в морской воде с соленостью 32‰ и температурой 15°C в первом случае, тогда как во втором случае исследование проводилось в солоноватой воде с соленостью 15‰ и температурой 12°C. Наконец, Лонг и др. (15) продемонстрировали, что в резервуарах, содержащих инфицированного атлантического лосося, с использованием модели заражения погружением, бактерия была впервые обнаружена через 12 дней после инфекции, а ее уровни достигли пика через 36 дней после инфекции, за 3 дня до среднего дня смерти. С 44-го дня после инфекции уровни P. salmonis в водяном столбе оставались близкими к пределу обнаружения и совпадали с прекращением острой смертности. Таким образом, самые высокие уровни P. salmonis выделяются незадолго до смерти, и атлантический лосось, переживающий вспышку SRS, наиболее заразен в период между 18 и 42 днями после инфекции.

Коммерческие вакцины представлены в основном бактеринами, рекомбинантными (1) и аттенуированными живыми бактериальными вакцинами, вводимыми преимущественно в виде эмульсий типа «вода-в-масле» (25) (Таблица 1). Независимо от вида выращиваемого лосося, эти вакцины против SRS не обеспечивают полной защиты в отношении снижения общей смертности или задержки времени до начала первой вспышки SRS в полевых условиях в Чили (1, 26, 27). Пероральная иммунизация является привлекательной альтернативой, главным образом из-за ее более низкой стоимости и простоты введения выращенной рыбе. Было высказано предположение, что несколько пероральных иммунизаций против SRS необходимы для поддержания гуморального адаптивного иммунного ответа у выращенной рыбы, выраженного в виде специфических к SRS антител, и для поддержания защиты рыбы на протяжении всего производственного цикла (22, 28). Такой сценарий может быть биологически правдоподобным в случае заболеваний, вызванных вирусами или внеклеточными бактериями, но факультативно внутриклеточная природа P. salmonis требует, чтобы по-настоящему эффективная вакцина активировала клеточно-опосредованный адаптивный (CMI) ответ в течение достаточно длительного времени для защиты популяции лосося на протяжении всего производственного цикла в морской воде. К сожалению, P. salmonis точно модулирует и нарушает CMI-ответ у инфицированной рыбы как механизм уклонения от защиты хозяина (10–13, 29, 30). Другие внутриклеточные бактерии, важные в аквакультуре, такие как Renibacterium salmoninarum и Edwardsiella tarda, модулируют CMI сходным образом. Розас-Серри и др. (31) продемонстрировали, что нагрузка R. salmoninarum имела значительную положительную корреляцию с пониженной регуляцией ifnγ, eomes, tbet, gata3, il2, il12, cd8 и mpeg1 (перфорин) в головной почке предсмолтов атлантического лосося; следовательно, R. salmoninarum не вызывал CMI-ответ у рыбы, инфицированной при 11 или 15°C. Ямасаки и др. (32) показали важную роль CMI, а не гуморального иммунитета против инфекции E. tarda у карпа гиббуна. Бактериальный клиренс в почках и селезенке наблюдался после повышения цитотоксической активности и увеличения количества CTL, но титры специфических к E. tarda антител не увеличивались до тех пор, пока не произошел бактериальный клиренс, что свидетельствует о том, что индукция гуморального иммунитета запаздывает для обеспечения защиты. Продолжительность времени, в течение которого CD8+ клетки остаются активными для «убийства» инфицированных клеток после инфекции P. salmonis и/или вакцинации, неизвестна, поэтому оптимальные уровни активации CD8+ клеток, способные обеспечить защиту у лосося, также неизвестны. Более того, степень, в которой мукозальная вакцинация может вызвать защитный иммунитет против внутриклеточно реплицирующихся бактерий, остается неясной, в отличие от случаев вирусных и внеклеточных бактериальных инфекций, для которых защитные механизмы были широко изучены (33, 34). Следовательно, практические условия, при которых внутриклеточная вакцинация трансформируется в защитные CMI-ответы, не были определены для вакцин против SRS.

Таблица 1 Сводка экспериментальных исследований по оценке эффективности инъекционных и пероральных вакцин, типов использованных антигенов и доступности коммерческих вакцин.

Информация о коммерческих вакцинах взята из официальных записей Сельскохозяйственной и животноводческой службы (SAG), Чили. Отсутствуют результаты эффективности в полевых условиях на выращиваемых лососевых в Чили для любой из этих инъекционных вакцин, доступны только полевые результаты, которыми управляют производящие компании в конце каждого цикла выращивания. RPS — относительный процент выживаемости; ARR — абсолютное снижение риска; NNT — количество пациентов, необходимое для лечения.

Ямасаки и др. (35) также показали важность CMI против инфекции E. tarda с использованием испытаний вакцин, сравнивающих эффекты живых и инактивированных формалином бактерий. Рыба, вакцинированная живыми клетками, показала высокие показатели выживаемости, высокие уровни экспрессии генов IFN-γ и T-bet и увеличение количества CTL. Напротив, вся рыба, вакцинированная бактеринами, погибла после заражения E. tarda и индуцировала высокие уровни экспрессии IL4/13a и IL-10, тогда как Th1-подобные ответы подавлялись. Розас-Серри и др. (29) показали, что у рыбы, вакцинированной бактерином P. salmonis, наблюдалась гиперэкспрессия MHCI, MHCII и CD4, но значительная пониженная регуляция CD8b и IgM, что свидетельствует о том, что инактивированная формалином бактерия способствовала ответу CD4+ Т-клеток, но не индуцировала иммунный ответ, опосредованный CD8+ Т-клетками, или гуморальный ответ. Уровень специфических к SRS антител, генерируемых вакцинами и/или парентеральными или пероральными бустерами, не коррелирует с уровнем защиты или снижением уровня смертности, связанной с SRS, в полевых условиях. По этой причине не наблюдается значительных различий между рыбой, получающей пятивалентную инъекционную вакцинацию плюс пероральный бустер, и рыбой, получающей ту же схему, но без перорального бустера (27). Аналогично, также нет различий в общей смертности или времени до первой вспышки у рыбы, получающей одну или несколько бустерных вакцин в морской воде, и рыбы, не получающей бустер (26).

В последние четыре года наша исследовательская группа оценивала иммунный ответ рыбы в полевых условиях против различных вакцин, включая живую аттенуированную вакцину против P. salmonis. В целом наблюдалась активация врожденного иммунного ответа и клеточно-опосредованного адаптивного ответа, модулируемая гиперэкспрессией ifnγ, il2, il10, il12, mhc1, cd4 и cd8 в головной почке смолтов атлантического лосося через 24 часа после вакцинации и через 150, 300, 460 и 600 градусо-дней перед переводом в морскую воду. Эти результаты часто отмечаются у рыбы, выращиваемой в рыбоводных хозяйствах с проточной водой при различных температурах воды (между 7 и 14°C) и в системах рециркуляционной аквакультуры (RAS), но ответ всегда значительно лучше у рыбы, содержащейся при более высоких температурах (> 12°C). Острое и хроническое воздействие субоптимальных температур часто оказывает подавляющее действие на иммунный ответ рыбы, особенно на адаптивный иммунитет (36). Санхуэса и др. (37) продемонстрировали, что поведенческая лихорадка у эктотермов приводит к нейроиммунному взаимодействию, которое может модулировать системный воспалительный ответ во время инфекции патогена. Результаты последнего временного периода плана мониторинга, проведенного через 1800 градусо-дней после вакцинации (1200 градусо-дней в морской воде), показали снижение экспрессии генов cd4 и cd8 — время, которое обычно совпадает с началом первых вспышек SRS на морских фермах атлантического лосося. Пониженная регуляция cd4 и cd8 в этой точке указывала бы на сниженный CMI-ответ, вероятно, связанный с постепенным использованием различных иммунных компонентов, ранее индуцированных вакциной, и/или связанный с естественным заражением.

Эти результаты согласуются с транзиторной стимуляцией CMI-ответа, описанной Варгасом и др. (38) у рыбы, иммунизированной той же вакциной в полевых условиях, поскольку они наблюдали повышенную экспрессию генов ifna, ifnγ, cd4, cd8a, il10 и tgfb через 5 дней после вакцинации, но снижение ответа через 15 и 45 дней после вакцинации. Однако результаты последнего исследования были получены от рыбы, вакцинированной инъекционной бустерной вакциной в морской воде, когда их средний вес составлял от 1 до 1,5 кг. В Чили 100% смолтов атлантического лосося, поступающих в море, вакцинированы вакциной, содержащей компонент P. salmonis, поэтому на эти результаты могут влиять пятивалентная инъекционная первичная вакцинация и естественное заражение после выхода в море. Хотя мы знаем, что современные вакцины недостаточно активируют CMI-ответ для защиты рыбы на протяжении всего производственного цикла, современные вакцины важны для относительного контроля SRS. Тем не менее, отмечается снижение защиты с точки зрения времени до первого обнаружения P. salmonis и вспышек SRS, увеличение числа терапий и увеличение связанной смертности, среди других индикаторов.

P. salmonis является факультативно внутриклеточной бактерией, поскольку, хотя она инфицирует лимфоидные клетки, такие как макрофаги, моноциты и нелимфоидные клетки in vitro и in vivo (39, 40), она может культивироваться in vitro на твердых и жидких средах, обогащенных цистеином (41). Кортес и др. (42) идентифицировали метаболические характеристики P. salmonis, которые различают два основных клада этого вида, и продемонстрировали, что P. salmonis может использовать различные экспериментально протестированные источники углерода во вновь разработанных средах. Геном P. salmonis содержит одну кольцевую хромосому размером 3 184 851 п.н. и три плазмиды: pPSLF89-1 (180 124 п.н.), pPSLF89-2 (33 516 п.н.) и pPSLF89-3 (51 573 п.н.) (43). In silico анализ нескольких штаммов P. salmonis показал открытый пангеном из 3463 генов и корегеном из 1732 генов (44). Плазмиды представляют собой внехромосомные кольцевые или линейные двухцепочечные молекулы ДНК, различающиеся по размеру, и некоторые бактерии содержат плазмиды без очевидных функций, которые классифицируются как криптические. Ортис-Северин и др. (45) идентифицировали четыре крупные криптические плазмиды в референтном штамме P. salmonis LF-89, а также двенадцать предполагаемых факторов вирулентности и два глобальных транскрипционных регулятора. Предполагается, что эти плазмиды имеют решающее значение для способности бактерии адаптироваться к окружающей среде, поскольку они кодируют белки, связанные с мобилизацией, транспортом и утилизацией питательных веществ.

Мауэль и др. (46) показали, что P. salmonis, выделенные в различных частях мира, включая референтный штамм LF-89, тесно связаны друг с другом (более 99% сходства по генам 16S, ITS и 23S), но чилийский изолят EM-90 уникален и генетически отличается от других. Позже эти данные были подтверждены дополнительными доказательствами из оценок их геномных структур и филогенетических взаимосвязей, подтверждающих существование двух геногрупп P. salmonis: LF-89 и EM-90 (44, 47–52). Пангеном P. salmonis LF-89 и EM-90 содержит 148 и 273 уникальных белка соответственно (44), и были описаны различные географические закономерности распространения и восприимчивость видов лосося (53). Это предположение также было экспериментально подтверждено исследованиями, основанными на мультилокусном секвенировании (MLST) и ПЦР-амплификации генов 16S рРНК с последующим типированием по полиморфизму длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) (51, 54). Хотя различные методы ПЦР в реальном времени TaqMan® в течение нескольких лет использовались частными диагностическими лабораториями для идентификации и различения изолятов LF-89 и EM-90 в чилийской лососевой промышленности, недавно был опубликован протокол мультиплексной ПЦР для дифференциации обеих геногрупп (52). P. salmonis может выживать ≥120 часов и реплицироваться в клеточных культурах, обогащенных макрофагами атлантического лосося (55). Эта стратегия может индуцироваться ограниченным лизосомным ответом, который может быть связан с механизмами уклонения от иммунного ответа хозяина P. salmonis. Позже Перес-Стуардо и др. (56) показали, что обработка IgM-шариками способствует лизосомной активности в клеточных культурах, обогащенных макрофагами атлантического лосося, инфицированных P. salmonis, путем снижения pH лизосом и увеличения протеолитической активности внутри лизосом, снижая бактериальную нагрузку и цитотоксичность, индуцированную P. salmonis. Искусственно вызванное лишение железа во время инфекции P. salmonis in vitro и in vivo с использованием хелаторов железа генерирует защитный ответ инфицированных клеток, совпадающий со снижением бактериальной нагрузки и повреждения клеток (57, 58).

Хотя в P. salmonis идентифицированы многочисленные гены, связанные с вирулентностью, лишь несколько кодируемых факторов вирулентности были охарактеризованы (Таблица 2). Протеолитические ферменты являются важными факторами вирулентности, поскольку они участвуют в инвазии клеток и внутриклеточной пролиферации. P. salmonis может синтезировать и секретировать сидерофоры (81), что подтверждает ее способность использовать различные источники железа. Кроме того, P. salmonis обладает протеазной активностью, которая значительно увеличивается, когда бактерия инфицирует клетки (62). В то же время в геномах различных штаммов P. salmonis были описаны геномные острова (73), что может объяснять различные уровни вирулентности геногрупп P. salmonis, патогенез (8, 14) и иммунный ответ, наблюдаемые как у рыбы, экспериментально зараженной различными геногруппами P. salmonis, так и у вакцинированной рыбы (11, 12, 14, 29). Внутриклеточные бактериальные патогены используют различные стратегии, позволяющие им прикрепляться к клеткам хозяина, проникать в них и реплицироваться, а также модулировать внутриклеточные процессы, такие как мембранный транспорт, сигнальные пути, метаболизм, гибель и выживание клеток (85). Одной из стратегий, используемых этими бактериями, являются системы секреции (СС), которые представляют собой сложные многобелковые трансмембранные наномашины, образующие канал для экспорта различных молекул, включая эффекторы вирулентности (86). P. salmonis имеет дефицит генов системы секреции типа IVB (Dot/Icm) и классифицируется как система секреции типа IVB (T4SS) (74, 75), которая описана как основной механизм вирулентности Legionella pneumophila и Coxiella burnetii и отвечает за их внутриклеточное выживание и репликацию (87). Временное подкисление бесклеточных сред приводит к гиперэкспрессии генов P. salmonis, которые ингибируют слияние фагосом с лизоцимом для предотвращения уничтожения в фаголизосомах (74). Дополнительно, Sec-зависимый путь и система секреции типа 4B биологически активны во время in vitro инфекции P. salmonis (76). Система секреции типа VI (T6SS) и типа III (T3SS) также присутствуют в геноме P. salmonis, но исследований, демонстрирующих их функциональный механизм, не проводилось.

Таблица 2 Факторы, связанные с вирулентностью, описанные у P. salmonis.

Предполагаемые токсины, кодируемые плазмидами, секретируются во внеклеточных везикулах (EV) P. salmonis (64, 79, 80, 88), что предполагает возможную роль этого важного мобильного генетического элемента в бактериальной вирулентности. Лейва и др. (89) идентифицировали 35 уникальных белков в сывороточных EV от рыбы, инфицированной P. salmonis, включая субъединицы протеасом, гранулины и главные комплексы гистосовместимости класса I (MHC-I) и класса II (MHC-II). Таким образом, эти результаты позволяют предположить, что высвобождение EV может быть частью механизма, посредством которого стимулирующие молекулы хозяина высвобождаются из инфицированных клеток для стимуляции иммунного ответа. Кроме того, у P. salmonis описаны другие механизмы патогенности, такие как везикулы наружной мембраны (OMV), содержащие различные белки, связанные с критическими функциями выживания, токсины, кодируемые плазмидами (64, 79, 80, 88), и пили типа IV, которые являются нитевидными структурами на поверхности бактерий, важными для прикрепления к поверхности клеток хозяина (82) (Таблица 3). Биопленки играют важную роль в патогенности бактерий, поскольку их физическая и пространственная организация препятствует доступу противомикробных препаратов и повышает их устойчивость к фагоцитозу. P. salmonis образует жизнеспособные, стабильные и толерантные к слизи кожи рыбы биопленки на абиотических поверхностях и в условиях сильного голодания по питательным веществам (69). Цитотоксический ответ клеточной линии головной почки лосося на P. salmonis показал межизолятные различия, поскольку биопленки изолята LF-89 были чувствительны к слизи кожи атлантического лосося во время раннего формирования, тогда как биопленки изолята EM-90 были более толерантны. Дополнительно, Сантибаньес и др. (90) показали, что планктонный изолят EM-90 и сессильный LF-89 генерируют наиболее высокие уровни вирулентности in vitro за счет модуляции провоспалительного ответа (il1b, il8, nfkb и ikba). NaCl и Fe значительно увеличивают продукцию биопленки. Оливер и др. (65) предположили, что присутствие Hsp60 (GroEL) в OMV P. salmonis может указывать на их важность во взаимодействии с белками хозяина и/или модуляции формирования биопленки.

Таблица 3 Основные белки, связанные с вирулентностью, описанные в мембранных везикулах штамма P. salmonis типа LF-89.

Legionella pneumophila является водным организмом, который взаимодействует с амебами и реснитчатыми простейшими как с естественными хозяевами, и это взаимодействие играет центральную роль в экологии бактерий и их инфекционности (70). Деклерк и др. (91) продемонстрировали, что, хотя L. pneumophila присутствовала в 100% плавающих биопленок в антропогенных водных системах, Naegleria spp. и Acanthamoeba spp. присутствовали в 50–92% и 67–72% образцов плавающих биопленок соответственно. Недавно Лабра и др. (92) продемонстрировали, что P. salmonis обнаруживается только у взрослых особей эктопаразита ракообразных Caligus rogercresseyi и присутствует только транзиторно после удаления хозяев, инфицированных P. salmonis, но бактерия не обнаруживается на стадиях халимуса или у планктонных личинок паразитов. Однако взаимосвязь P. salmonis с Neoparamoeba perurans, космополитической морской амебой и возбудителем AGD, остается неясной.

Теперь доступно больше информации для понимания процесса инвазии и выживания P. salmonis на внутриклеточном уровне (78, 83, 84). Хотя эти знания еще предстоит подтвердить in vivo с использованием рыбы, зараженной идеально через совместное содержание или погружение и в полевых условиях, это важный шаг вперед в систематизации и понимании биологии бактерии в клетках хозяина. Однако, как и в случае с другими внутриклеточными бактериями у млекопитающих и рыб, обычно мы видим, что эта битва между P. salmonis и защитой рыбы выигрывается бактерией, вероятно, потому что она обладает широким арсеналом высокоэффективных факторов вирулентности, позволяющих ей уклоняться от адаптивных клеточно-опосредованных иммунных ответов и изменять клеточно-автономный иммунитет клеток рыбы в свою пользу, способствуя благоприятной среде для своей репликации и хронического сохранения в животных (8).

P. salmonis может инфицировать, выживать и реплицироваться преимущественно в цитоплазматических вакуолях макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов, не индуцируя характерного цитопатического эффекта (40) (Рисунок 2), хотя ее репликация в других специализированных фагоцитарных клетках, таких как ДК и В-клетки, еще предстоит выяснить. В то время как биология макрофагов хорошо охарактеризована у млекопитающих, дифференцировка и активация макрофагов у костистых рыб еще не описаны должным образом. Макрофаги обладают высокой степенью пластичности и могут активироваться по классическому (M1 или провоспалительному) или альтернативному (M2 или противовоспалительному) пути (108). M1-макрофаги активируются IFN-γ и TNF-α и продуцируют провоспалительные цитокины и активные формы кислорода (ROS) для защиты от патогенов (109). M2-макрофаги активируются il4/il13, il10, tgfb и характеризуются более низкой микробицидной активностью, иммуносупрессией и стимуляцией роста клеток и заживления ран (110, 111). У моноцитов/макрофагов костистых рыб индуцируемая синтаза оксида азота (iNOS) является маркером M1-типа, а аргиназа 2 — маркером M2-типа (112). Смит и др. (113) наблюдали изменение морфологии, фагоцитарной способности и профиля miRNA лейкоцитов головной почки атлантического лосося (HKL) in vitro, показывая, что клетки дифференцируются из «моноцитоподобных» (День 1) в «макрофагоподобные» (День 5). В то же время содержание некоторых miRNA в EV значительно отличалось от содержания miRNA в HKL, что позволяет предположить, что эти miRNA участвуют в иммунном ответе и/или активации макрофагов (114). Смит и др. (115) выявили серьезные изменения в транскриптоме HDL в дни 1 и 5, включая изменения в экспрессии макрофагальных и иммунных транскриптов (csf1r, arg1, tnfa, mx2), метаболизма липидов (fasn, dhcr7, fabp6) и транскрипционных факторов, связанных с функцией и дифференцировкой макрофагов (klf2, klf9, irf7, irf8, stat1). Таким образом, популяция HKL дифференцируется in vitro в макрофаги без добавления экзогенных факторов.

Рисунок 2 Схематическое обобщение путей, используемых P. salmonis для проникновения в клетку, и модулируемых иммунных ответов. Эта информация обобщена с результатами, описанными в различных in vitro и in vivo транскриптомных и протеомных исследованиях. Фагоцитоз, ключевой в жизненном цикле P. salmonis, также является ее основным путем патогенеза. Взаимодействие P. salmonis с клетками хозяина было описано в различных транскриптомных и протеомных исследованиях in vitro и in vivo (10–13, 29, 30, 78, 89, 93–107). Инфекция P. salmonis состоит из ранней, или вакуолизационной, стадии и поздней, или стадии распространения. (1) Несколько исследований показали, что основной путь проникновения бактерии в рыбу — через жабры и кожу, и в гораздо меньшей степени — пероральный путь. (2) P. salmonis интернализуется путем клатрин-зависимого эндоцитоза в фагоцитарные клетки. Белки пилей, бета-гемолизин и T6SS являются характерными признаками вакуолизационной стадии. Транспорт углеводов, аминокислот, пептидов, железа и других питательных веществ усиливается внутри PCV. (3) После попадания внутрь происходит значительная реорганизация цитоскелета с изменением актиновых филаментов, тубулинов, миозинов и септинов, и P. salmonis одновременно способствует инактивации GTPаз. P. salmonis вызывает значительное ингибирование антиоксидантного ответа, что способствует созданию окислительной ниши. В целом, P. salmonis изменяет ремоделирование цитоскелета, внутриклеточный транспорт, организацию органелл, транспорт везикул и эндосом, а также компоненты ранних эндосом. Распознавание антигенов (LPS, флагеллин и др.) осуществляется PRR макрофагов и дендритных клеток (ДК), такими как TLR5, DC-SIGN или CD209, C-тип лектин (CD299, Mincle) и NLR. ДК играют важную роль в ответе на P. salmonis, модулируя активацию NF-kB, распознавание патогенов, фагоцитоз и продукцию цитокинов и хемокинов, управляемую IFN-опосредованным ответом, который способствует Th1-поляризации Т-клеток. В то же время, для повышения своего выживания в инфицированных клетках, P. salmonis повышает регуляцию IL-10, но понижает регуляцию IL-12, что способствует Th1-поляризации. P. salmonis индуцирует флагеллин-зависимую активацию TLR5, что приводит к продукции TNFα, IL-1β и IL-8. P. salmonis способствует экспрессии антимикробных пептидов, таких как гепсидин и кателицидин, и компонентов острой фазы, таких как гаптоглобин, гемоглобин, коллектрины, С-компонент маннозосвязывающего белка, компоненты комплемента (C3, C6, C9) и CD163. Все эти данные подтверждают, что P. salmonis создает специфическую среду, способствующую ее выживанию и репликации в макрофагах. Во время стадии распространения увеличиваются размер и количество клеток и везикул P. salmonis, ограничивается доступность питательных веществ, запускается строгий ответ. В обоих случаях — у P. salmonis и у клеток хозяина — усиливаются биосинтетические процессы, а также захват железа, белки-транспортеры железа и ответы острой фазы. Увеличивается экспрессия генов Dot/Icm T4SS, токсинов, эффекторных белков, мобилома, транспозонов и белков, связанных с фагами, вероятно, в качестве подготовки к выходу из клетки. Многие факторы вирулентности, повышенные на обеих стадиях инфекции, соответствуют белкам, кодируемым плазмидами, что подтверждает гипотезу о важности плазмид P. salmonis в инфекционном процессе. P. salmonis модулирует иммунный ответ против внутриклеточных патогенов, способствуя пролиферации клеточного цикла и подавляя апоптоз, а также изменяя транспорт везикул и парацеллюлярную проницаемость. P. salmonis изменяет активность пероксисом как часть своей инфекционной стратегии, индуцируя тем самым измененный клеточный окислительно-восстановительный баланс, воспаление и иммунный ответ. Более того, P. salmonis снижает скорость деградации белков убиквитин-протеасомной системой, связанной с ответом на клеточный стресс и стресс эндоплазматического ретикулума, связанный с несвернутыми белками, как механизм повышения своего выживания внутри клеток хозяина. (4) Процессинг и презентация антигенов. Т-клетки распознают только фрагменты антигенов, связанные с MHC-I или MHC-II на АРС. Антигены, представленные MHC-I, процессируются через протеасому и переносятся в эндоплазматический ретикулум с помощью транспортера, связанного с процессингом антигена (TAP), где они ассоциируются с MHC-I и, наконец, транспортируются к клеточной мембране. Антигены, представляемые MHC-II, включаются в клетки путем эндоцитоза, перевариваются в лизосомах и загружаются на молекулы MHC-II перед миграцией к клеточной поверхности. Однако P. salmonis ингибирует путь MHC-I (пониженная экспрессия генов mhc1, cd8, tcra, tcrb), но активирует путь MHC-II (mhc2, cd4), поэтому ее стратегия заключается в уклонении от иммунного ответа, опосредованного CD8+ Т-клетками. P. salmonis увеличивает экспрессию важных ко-стимулирующих молекул на поверхности макрофагов (cd80/86, cd83) и снижает экспрессию zbtb46 — транскрипционного фактора, ингибирующего созревание АРС. (5) Активация и дифференцировка Т-клеток. CD4+ Т-хелперные клетки могут дифференцироваться в популяции Th1, Th2, Th17 и Treg, которые играют различные роли в иммунном ответе. IL-12 способствует дифференцировке CD4-клеток в Th1-клетки для уничтожения внутриклеточных патогенов, в то время как IL-2, IL-4, IL-13A и IL-10 способствуют дифференцировке Th2-клеток в ответ на бактерии и внеклеточные паразиты. Однако P. salmonis способствует продукции IFN-γ, но снижает продукцию IL-12, снижает экспрессию специфичных для Th1-поляризации транскрипционных факторов (tbet, eomes) и, способствуя экспрессии гранузима A (gzma), снижает продукцию перфорина (mpeg1). Кроме того, P. salmonis увеличивает экспрессию специфичного для Treg-поляризации транскрипционного фактора (foxp3), что указывает на активацию ответа иммунной толерантности.

Макрофаги, инфицированные P. salmonis, индуцируют противовоспалительную среду, вероятно, участвующую в развитии механизма бактериальной вирулентности для обеспечения репликации и выживания (11, 12, 93). Воздействие инфекции зависит от баланса между способностью макрофагов распознавать и уничтожать бактериальные патогены и способностью патогенов нарушать функции этих макрофагов (112). Внутриклеточные патогены используют несколько механизмов подавления иммунных ответов хозяина (116), таких как: (a) уклонение от распознавания иммунной системой хозяина, включая модуляцию микробных поверхностей, секрецию иммуномодуляторов, антигенную вариабельность и укрытие в клетках или тканях-мишенях; и (b) модуляция и подавление иммунных ответов хозяина, такие как уклонение от фагоцитоза, рецепторов врожденного иммунитета, системы комплемента, цитокинов или хемокинов, ингибирование апоптоза, устойчивость к эффекторным механизмам хозяина и индукция неадекватных иммунных ответов, таких как иммуносупрессия и индукция Treg. Одной из наиболее важных стратегий, используемых P. salmonis, является уклонение от фаго-лизосомальной деградации (55, 56, 74, 76), но она также способна активировать механизм подавления защиты хозяина путем ингибирования слияния с лизосомальным компартментом хозяина и изменения pH лизосом (74). Более того, P. salmonis может выходить в цитозоль и реплицироваться в цитоплазме клеток хозяина (39). P. salmonis может противостоять эффекторным механизмам хозяина, поскольку она способна сохраняться в макрофагах (63), ингибировать апоптоз (40), подавлять процессы окислительного стресса и способствовать клеточному циклу (10, 12, 13, 78, 83). Наконец, P. salmonis индуцирует неадекватный иммунный ответ, иммуносупрессию (10–13, 29) и дифференцировку Treg (94).

При попадании в макрофаги через фагоцитоз P. salmonis организует формирование вакуолей, называемых вакуолями, содержащими P. salmonis (PCV), и уклоняется от лизосомального пути деградации, выходя в цитоплазму (39, 40, 74). Клатрин и актиновый цитоскелет играют ключевую роль во внутренней интернализации и размножении P. salmonis соответственно (12, 95, 96). PCV образуются потому, что P. salmonis полностью использует дезорганизованный и синтезированный de novo актин в свою пользу, генерируя трехмерные вакуоли, по-видимому, состоящие исключительно из актина на поздних стадиях инфекции (95). Клатрин-опосредованный эндоцитоз является хорошо документированным путем проникновения для многих внутриклеточных бактерий и вирусов (117). Фагоцитоз, ключевой элемент жизненного цикла L. pneumophila и P. salmonis, также участвует в их патогенезе. В обоих случаях ключевой частью патогенетического процесса являются гены и генные комплексы, используемые для секреции морфологических структур (например, пилей) или реактивных белков. Несколько белков, продуцируемых L. pneumophila, позволяют ей уклоняться от клеточного иммунного ответа и реплицироваться внутри макрофагов. Некоторые из этих белков — фактор вирулентности BipA/TypA и белок теплового шока ClpB, оба из которых были подробно охарактеризованы (118). Исла и др. (63) показали значительное увеличение экспрессии белков ClpB и BipA во время инфекции клеток SHK-1 P. salmonis, благодаря чему эти факторы вирулентности используются бактерией для уклонения от механизмов клеточной деградации и стимуляции своей репликации внутри макрофагов.

Внутри клеток P. salmonis чередует репликативную и стационарную фазы, в которых активируется строгий ответ (78, 83, 84). P. salmonis индуцирует прерывание трансляции во время своей внутриклеточной репликации, и система секреции Dot/Icm типа IVB играет важную роль в этом процессе (83); однако все еще существует множество неисследованных генов, активных во время внутриклеточной инфекции бактерии. Глобальное протеомное профилирование для идентификации дифференциально экспрессируемых белков в макрофагоподобных клетках атлантического лосося, зараженных P. salmonis на разных стадиях инфекции, было описано (78, 84). Эти результаты подтверждают предыдущие данные на транскриптомном уровне и ценны для понимания биологических путей инфекции P. salmonis in vitro на уровне белка, но необходимость получения этих знаний от экспериментально и естественно инфицированной рыбы in vivo сохраняется. Модель инфекционного процесса P. salmonis, основанная на стадии вакуолизации и стадии распространения, может быть предложена на основе транскриптомных и протеомных результатов (10, 12, 13, 30, 78, 83, 84, 93, 95–97) (Рисунок 2).

Строгий ответ является одним из таких адаптивных механизмов, с помощью которых P. salmonis может выживать в условиях голодания по питательным веществам и других связанных стрессов (119). Было высказано предположение, что голодание по аминокислотам и жирным кислотам запускает RelA и SpoT для продукции сигнальных нуклеотидов — гуанозинтетра- и пентафосфата ((p)ppGpp) у различных бактерий (120). Зунига и др. (84) описали повышение регуляции этих ключевых генов во время стационарной фазы и внутриклеточного роста P. salmonis, включая гены, кодирующие двухкомпонентную сенсорную киназу LetS, сигма-фактор стационарной фазы RpoS и (p)ppGpp-синтетазу и/или гидролазу RelA и SpoT, которые, как было показано, играют важную роль в регуляции вирулентности у L. pneumophila и C. burnetii (121). Во время поздних стадий инфекции LCV нарушается, что приводит к выходу бактерий в цитозоль. При истощении питательных веществ запускаются RelA и SpoT, что приводит к повышению уровней ppGpp, который запускает фенотипический переход в стационарную фазу (122).

Микробные инфекции характеризуются постоянным взаимодействием между патогенами и хозяевами, при этом патогены используют различные функции хозяина во время инфекции, а хозяева реагируют соответствующими защитными реакциями. Поэтому понимание взаимодействия хозяина и патогена имеет решающее значение для разработки эффективных вакцин и терапий. Антигенпрезентирующие клетки (АРС), такие как макрофаги и дендритные клетки (ДК), распознают бактерии через рецепторы распознавания паттернов (PRR), активируемые молекулярными паттернами, ассоциированными с патогенами (PAMP). Среди основных PRR и PAMP — Toll-подобные рецепторы (TLR) и флагеллин соответственно (Рисунок 2). P. salmonis имеет полный и организованный набор генов жгутика, хотя структурный жгутик для этой бактерии никогда не был описан (123). Связывание флагеллина с TLR5 активирует MyD88-зависимый путь, приводящий к активации IRAK-1/4 и TRAF-6 и в конечном итоге к активации NF-κB, которая индуцирует экспрессию провоспалительных цитокинов (124). Анализы обогащения дифференциально экспрессируемых генов выявили несколько центральных сигнатур после инфекции, включая положительную регуляцию сигнального пути TLR5, которая сходилась на уровне NF-kB для модуляции провоспалительного цитокинового ответа (12). Флагеллин различных бактерий индуцирует повышение регуляции кателицидина (camp) in vitro, и TLR5 участвует в сигнальном пути (125). Розас-Серри и др. (12) наблюдали повышение регуляции tlr5 и camp у рыбы, инфицированной P. salmonis. Недавно Муньос-Флорес и др. (126) показали, что MyD88 является важным адаптерным белком в активации сигнального пути TLR5M/TLR5S, опосредованного флагеллином P. salmonis, во время in vitro инфекции. Многочисленные in vitro и in vivo анализы предполагают возможное использование флагеллина в качестве иммуностимулятора или адъюванта вакцины (127). Жгутиковый белок FlgG P. salmonis обеспечил самый высокий уровень защиты с относительным процентом выживаемости (RPS) 95% (21). Недавно Гонсалес-Штегмайер и др. (128) продемонстрировали, что полноразмерный рекомбинантный флагеллин B из Vibrio anguillarum (rFLA) и его рекомбинантный D1-домен (rND1) индуцируют экспрессию генов, участвующих в воспалительном ответе, быстро и в течение короткого времени, и эти эффекты могут проявляться при использовании молекул по отдельности или в комбинации с коммерческой вакциной против P. salmonis.

P. salmonis индуцирует значительную реорганизацию цитоскелета, но снижает активность лизосомальных протеаз и вызывает деградацию белков, связанных с клеточным стрессом (12, 95) (Рисунок 2). Инфекция P. salmonis также задерживает транспорт белков, процессинг антигенов, транспорт везикул и аутофагию, но способствует выживанию и пролиферации клеток и ингибирует апоптоз (12). Поскольку было показано, что P. salmonis подвергается как репликации, так и деградации внутри макрофагов головной почки радужной форели, бактериальные антигены потенциально могут быть представлены через систему MHC-II (39). Альтернативно, поскольку было показано, что бактерия ингибирует слияние фагосом и лизосом, P. salmonis может оставаться внутри фагосом для репликации с последующим высвобождением или выходом (74).

Сообщается, что IFN способствует повышению экспрессии маркеров, связанных с АРС (MHC-I и MHC-II), и понижению регуляции ZBTB46 у радужной форели, что является транскрипционным фактором, ингибирующим созревание АРС (129, 130). Недавно было показано, что IFN-γ способствует экспрессии поверхностных маркеров клеток (CD80/86, CD83 и MHC-II) и снижению экспрессии zbtb46 в субпопуляциях мононуклеарных спленоцитов атлантического лосося (98). В совокупности эти результаты подтверждают, что IFN-γ, стимулируемый P. salmonis, модулирует взаимодействие между АРС и поляризацией Т-клеток, и что оптимальный процесс презентации антигена необходим для активации защитного CMI-ответа. Тем не менее, необходимо дополнить эти результаты экспрессией соответствующих молекулярных компонентов этих маркеров на Т-клетках, таких как CD28 и CTLA4. Кроме того, была описана повышенная регуляция транскрипционного фактора foxp3 в спленоцитах радужной форели, совместно культивируемых как с IFN-стимулированными клетками, так и с клетками, стимулированными белками P. salmonis (94), что демонстрирует взаимосвязь между АРС и лимфоцитами, которая способствует поляризации в сторону фенотипа Treg. Однако различные транскриптомные результаты показали, что P. salmonis эффективно модулирует повышение регуляции MHC-II и CD4 Т-клеток и антительные ответы, но эти индикаторы не коррелируют с защитой вакцин или лучшими показателями выживаемости в полевых условиях. Более того, P. salmonis индуцирует пониженную регуляцию CMI-ответа, управляемого цитотоксическими CD8 Т-клетками.

Транскриптомный анализ выявил глобальное прекращение трансляции во время внутриклеточного роста P. salmonis, и было высказано предположение, что внутриклеточная P. salmonis чередует репликативную фазу и стационарную фазу, во время которой активируется строгий ответ (83). Исследования функциональной геномики P. salmonis in vitro и in vivo у лосося были сосредоточены на изменениях экспрессии кодирующих генов (10, 12, 13, 30, 83, 97–99), экспрессии малых/микрокодирующих РНК (100) и экспрессии длинных некодирующих РНК (96) (Таблица 4). Кроме того, Лейва и др. (89) показали значительное изменение метилирования ДНК у кижуча, инфицированного P. salmonis, с временной динамикой во время инфекции. Количество дифференциально метилированных областей и связанные с ними метаболические пути подтверждают гипотезу о том, что эпигенетические изменения в геноме инфицированного кижуча могут модулироваться P. salmonis. Скелетные мышцы форели являются иммунологически активным органом, который может реализовать ранний иммунный ответ против P. salmonis (101). Фактически, этот ответ может дифференцированно регулироваться кортизолом, что может приводить к бактериальным вспышкам в мышцах в условиях стресса (102, 103). Общий транскрипционный ответ, связанный с клатрин-опосредованным эндоцитозом и гомеостазом железа, был показан в различных тканях (12, 96, 97, 104, 105). Двойной глобальный транскриптомный анализ выявил зависимость бактерий от метаболизма хозяина и доступности питательных веществ (30). Интересно, что полногеномные сравнения P. salmonis выявили отсутствие биосинтетического пути для валина, лейцина и изолейцина. Когда эти аминокислоты ограничены, динамика роста бактерий значительно нарушается, но это состояние обращается вспять при повторном добавлении аминокислот. Все эти транскриптомные анализы предоставили доказательства биологических процессов хозяина, клеточных компонентов и молекулярных функций во время инфекции P. salmonis для уклонения от иммунного ответа, индукции значительной реорганизации цитоскелета и стимуляции внутриклеточного выживания и репликации. NOD-подобные рецепторы (NLR) являются внутриклеточными рецепторами, ответственными за распознавание патогенов. Понтиго и др. (106) описали два различных изоформа SsNLRC3 у атлантического лосося, инфицированного P. salmonis, причем изоформа может иметь различную функцию в распознавании бактериальных лигандов во время инфекции. Однако эти результаты позволяют предположить, что, подобно L. pneumophila (131), P. salmonis способствует пироптозу — типу программируемой клеточной смерти, связанной с инфекцией внутриклеточными патогенами, характеризующейся формированием инфламмасомы, активацией каспазы-1 и продукцией провоспалительных цитокинов.

Таблица 4 Исследования транскриптомики in vivo, описывающие врожденный и адаптивный иммунные ответы у атлантического лосося и кижуча, инфицированных P. salmonis.

У лососевых адаптивная иммунная система состоит из CMI, механизм действия которой заключается в «убийстве» и элиминации клеток, инфицированных патогенами, и гуморального иммунитета, который основан на антителах для нейтрализации патогенов в жидкостях и тканях. Поскольку P. salmonis является бактерией, реплицирующейся внутри клеток хозяина, она недоступна для нейтрализующих антител во внеклеточном матриксе, поэтому клеточно-опосредованный иммунитет играет ключевую роль. Все Т-клетки обладают Т-клеточным рецептором (TCR), с помощью которого они распознают пептиды, представленные MHC, наряду с CD3 и ко-стимулирующими (CD28) и ко-ингибирующими (CTLA-4) поверхностными молекулами (133). Гены, ассоциированные с Т-клетками, и кодируемые ими белки с Т-клеточной активностью у рыб хорошо документированы (134). Присутствие цитотоксических Т-клеток (CTL) и Th-клеток у рыб идентифицировано как CD8+ и CD4+ Т-клетки соответственно (135, 136). В случае CMI против P. salmonis, CD8 Т-клетки должны распознавать инфицированные клетки путем связывания с молекулами MHC-I, экспрессирующими пептиды, процессированные из внутриклеточных патогенов. Лиганды MHC-I связываются со своими соответствующими TCR на поверхности CD8+ Т-клеток (137). Кроме того, ко-стимулирующие маркеры CD28 или отрицательные регуляторные маркеры CTLA-4 должны опосредовать взаимодействие между CD8+ клетками и молекулами MHC (138). После связывания с молекулами MHC-I наивные CD8 клетки активируются в эффекторные CTL, которые секретируют цитотоксические гранулы, содержащие перфорины и гранузимы. Перфорины образуют поры в мембранах клеток-мишеней, позволяя гранузимам, которые являются сериновыми протеазами, проникать в клетки-мишени и расщеплять белки хозяина для индукции апоптоза. Для выполнения своих эффекторных функций CD8+ Т-клеткам помогают CD4+ Т-клетки.

Дифференцировка наивных CD4+ Т-клеток в Th1-клетки опосредуется IL-12 и IFN-γ (139), которые играют решающую роль в паракринной и аутокринной модуляции АРС в активации CD8+ Т-клеток против внутриклеточных патогенов. Поэтому лучшее понимание сигналов цитокинов, способствующих дифференцировке CD4+ в CD8+ Т-клетки, а также ко-стимулирующих сигналов между АРС и Т-клетками, необходимо для понимания иммуномодуляторов, способных активировать защитный CMI-ответ против P. salmonis. Антительные ответы обычно наблюдаются у рыбы, вакцинированной против SRS в полевых условиях, но эти гуморальные иммунные ответы не коррелируют с показателями смертности и поэтому не обеспечивают защиты на протяжении всего производственного цикла (1, 26, 27). Однако, хотя антитела могут реагировать с P. salmonis до проникновения в клетки хозяина или во время передачи от клетки к клетке, реальная задача состоит в разработке защитных вакцин на основе CMI. Розас-Серри и др. (11, 12) продемонстрировали, что P. salmonis индуцирует IFN-индуцируемый ответ (IRF-1, GBP-1, IFN), но наблюдались гиперэкспрессия CD4 и гипоэкспрессия CD8b, что позволяет предположить, что P. salmonis модулирует уклонение от CMI, управляемое CD8+ Т-клетками, и способствует ответу CD4+ Т-клеток во время поздней фазы инфекции как механизм уклонения от защиты хозяина (Рисунок 2). Этот механизм может объяснять высокие бактериальные нагрузки, тяжелые патологические поражения, высокую кумулятивную смертность и низкую выживаемость у рыбы, инфицированной P. salmonis (8). В целом, механизмы, используемые внутриклеточными бактериями для запуска активации CD8+ клеток, не были полностью выяснены у рыб, в отличие от вирусных инфекций (140).

Вирусы, имеющие экономическое значение в лососеводстве, например, ISAV, IPNV и SAV, относительно хорошо контролируются вакцинами, включая обычные вакцины, такие как вирины; эти вирусы интегрированы в более глобальную стратегию, учитывающую генетическое управление устойчивостью, контроль производственных условий, эпидемиологический надзор и специальные нормативы для контроля. ISAV активирует быструю и длительную индукцию генов пути MHC-I в клетках почки атлантического лосося — эффект, опосредованный вирус-индуцированным IFN типа I (141). Эти наблюдения позволяют предположить, что IFN типа I у лосося имеет важные иммуномодулирующие функции в активации механизма MHC-I в ответ на инфекцию ISAV и что, в отличие от гриппа и многих других вирусов, ISAV, по-видимому, не препятствует экспрессии MHC и IFN. Это может подтверждать тезис о том, что лосось может обеспечить эффективный CMI-ответ, поскольку вирусы фагоцитируются, включаются в антигенпрезентирующие клетки и процессируются в цитоплазме вакуолей, а их иммуногенные структуры представляются через MHC-I Т-клеткам для окончательной дифференцировки в CD8+ Т-клетки. Так что же происходит с P. salmonis, если она также реплицируется внутри вакуолей в цитоплазме клетки? Когда бактерия жива и инфицирует рыбу, вероятно, что факторы вирулентности бактерии поддерживают ее стратегию уклонения от процессинга антигенов и/или MHC-I неэффективно представляет антигены, и бактерии в конечном итоге удается уклониться от ответных механизмов рыбы. Следующий вопрос тогда будет заключаться в том, является ли это причиной того, что рыба также не может активировать ответ против вакцины типа бактерина или даже живой аттенуированной вакцины. Следовательно, выяснение того, какие белки P. salmonis участвуют в изменении процессинга и/или презентации ее антигенов в клетках хозяина и как они действуют, может предоставить информацию для подтверждения гипотезы о том, что бактерия способна изменять этот клеточный механизм для уклонения от CMI.

Вероятно, это связано с селективным давлением, оказываемым иммунной системой, многие вирусы выработали белки, которые препятствуют презентации антигенов молекулами MHC-I (142). Вирусные белки были охарактеризованы как использующие узкие места в пути MHC-I, такие как транслокация пептидов транспортерами, связанными с процессингом антигенов (143). Альтернативно, вирусные белки могут вызывать деградацию или неправильную локализацию молекул MHC-I. Это часто достигается путем нарушения собственных путей деградации и транспорта белков клетки-хозяина. Процессинг и презентация антигенов молекулами MHC является краеугольным камнем иммунитета позвоночных. У костистых рыб описано шесть различных линий MHC-I: U, Z, S, L, P и H (144, 145). Хотя структурно они сходны с классическими молекулами MHC-I, все они принадлежат к линии U (Sasa-uba), и многие неклассические молекулы / молекулы, подобные MHC-I (гены линии L: Sasa-lda, Sasa-lia, Sasa-lca, Sasa-lfa, Sasa-lga и Sasa-lha), выполняют функции, отличные от презентации пептидов, — от гомеостаза хозяина до иммунной регуляции (146). Используя две отдельные модели заражения in vivo на атлантическом лососе с различной кинетикой и иммунной патологией в сочетании со стимуляцией in vitro вирусными и бактериальными TLR-лигандами, Свеннинг и др. (147) показали, что синтез de novo различных генов линии L дифференцированно регулируется в ответ на различные типы иммунных вызовов. Таким образом, в то время как альфа-вирус лососевых 3 (SAV3) сильно индуцировал экспрессию lia, lga и, в меньшей степени, lha, но не lda, lca или lfa, инфекция P. salmonis приводила преимущественно к положительной регуляции lga. Индукция lca, которая преимущественно экспрессируется в первичных и вторичных лимфоидных тканях, была незначительной, за исключением транзиторной повышенной регуляции в поджелудочной железе после заражения SAV3.

Вакцинация против P. salmonis: миссия выполнима?

Биобезопасность, вакцинация и селекция на устойчивость к болезням являются основными инструментами борьбы с инфекционными заболеваниями в аквакультуре. Однако генетика хозяина и вакцины обеспечивают лишь частичную защиту, что вызывает опасения по поводу их эффективности в полевых условиях. Патогены можно разделить на внеклеточные, факультативно внутриклеточные и облигатно внутриклеточные. Внутриклеточные патогены создают особые проблемы для иммунной системы, поскольку независимо от того, подвергаются ли они воздействию внеклеточно, они не могут быть напрямую контактированы иммунными клетками или гуморальными факторами, такими как антитела. Цель вакцинации — обучить адаптивную иммунную систему рыбы путем воздействия патогенных антигенов, чтобы при последующем контакте иммунная система быстро и долгосрочно реагировала на тот же патоген. Успех вакцинации против бактериальных заболеваний у рыб в основном приписывается вакцинам, нацеленным на внеклеточные патогены, поскольку они активируют антитело-опосредованный гуморальный адаптивный иммунитет (148). Однако циркулирующие антитела не защищают от инфекции P. salmonis или развития заболевания, поскольку P. salmonis является факультативно внутриклеточной бактерией. Поэтому стимуляция процесса презентации и процессинга антигенов P. salmonis является начальной целью вакцин, которые затем направлены на модуляцию иммунологической памяти; но именно эти процессы являются одним из текущих ограничений у рыб. Хотя сообщается, что IFN-γ способствует экспрессии поверхностных маркеров АРС, которые являются ключевыми в ко-стимуляции сигнала для активации Т-клеток и Th1-поляризации, он также может способствовать поляризации в сторону Treg (94), что указывает на профиль иммунной толерантности, требующий дальнейшего исследования, поскольку это может быть причиной ингибирования воспалительного ответа для стимуляции противовоспалительного ответа, определяющего персистирующую инфекцию и хроническое течение болезни у рыб. Неизвестно, может ли усиленный воспалительный ответ, вызванный высокодеструктивными провоспалительными макрофагами, хотя они являются важной частью Th1-поляризации, управлять CMI, способным контролировать механизмы уклонения P. salmonis. Напротив, чрезмерная активация IFN-γ-опосредованного воспалительного ответа (11, 12), по-видимому, увеличивает восприимчивость инфицированной рыбы, что приводит к прогрессированию ответа от острой до хронической стадии и приводит к усилению внутриклеточной репликации P. salmonis, высоким бактериальным нагрузкам, серьезным патологическим поражениям и низкой выживаемости (8). Кроме того, Илиев и др. (149) показали, что мощные иммуностимулирующие свойства TLR-лиганда не обязательно трансформируются в усиление функций АРС, и подчеркивают сложность активации иммунных клеток рыб TLR-лигандами.

Сказанное выше указывает на необходимость модуляции и активации CMI-ответа, но доступные вакцины не вызывают эффективной презентации антигенов через MHC-I, и отсутствует адекватная активация и экспансия Т-клеток, особенно CD8+ цитотоксических Т-клеток (29, 38). Эффективность вакцин, сообщаемая по результатам экспериментальных заражений, всегда была приемлемой (1, 25), но современные стратегии вакцинации в полевых условиях, будь то на основе реплицирующихся или нереплицирующихся вакцин, показали лишь транзиторную активацию гуморального иммунного ответа и, в частности, CMI-ответа, которые недостаточно сильны или длительны для достижения эффективного контроля SRS (1, 26, 27, 29, 38). Основываясь на современном понимании ограничений вакцин для борьбы с SRS и внутриклеточной природы P. salmonis, другие вакцины могут быть предпочтительными. Новая иммуноинформатическая стратегия для разработки вакцин с использованием эпитопов антигенных белков бактерий и вирусов, которые напрямую стимулируют активацию и дифференцировку Т- и В-клеток, используется в медицине человека. Хотя это пока не является популярной стратегией у рыб, сообщается о разработке и создании мультиэпитопных вакцин против Flavobacterium columnare (150), E. tarda и F. columnare (151), Streptococcus agalactiae (152) и E. ictaluri (153). Эта in silico стратегия была использована консорциумом чилийских организаций для разработки химерной мультиэпитопной вакцины, нацеленной на различные эпитопы P. salmonis.

Переменная и относительная защита современных вакцин против SRS в полевых условиях может быть следствием различных экологических переменных (1), выбора стратегии вакцинации (26, 27, 137), коинфекции с другими патогенами, такими как морские вши (154), или вариабельности генетической устойчивости к SRS среди семей (155). Таким образом, различные факторы, связанные с производством рыбы, могут приводить к повышенной восприимчивости, коинфекции и смертности. Эверсон и др. (156) показали важность экологических факторов, генетики хозяина и вакцинации в отношении инфекции и смертности, связанных с инфекционными заболеваниями. Однако основной причиной было бы недостаточная и/или транзиторная активация CMI-ответа, индуцируемая обычными вакцинами (1, 10–13, 25, 29, 38, 97, 105). Таким образом, перенос недавних знаний о взаимодействии рыбы и P. salmonis, в частности об иммунном ответе и ее патогенезе, в более эффективные вакцины или стратегии вакцинации не является простой задачей и остается одной из главных проблем в вакцинологии рыб.

Кинетика антительного ответа транзиторна после вакцинации в пресной воде, и уровни антител начинают снижаться примерно через 1800 дней после вакцинации (22). Однако механизмами, которые могут объяснить этот факт, являются естественное заражение и воздействие на рыбу P. salmonis и, как следствие, потребление антител, что наблюдалось у лосося, вакцинированного против IPN (140). Эти результаты подтвердили идею дополнения классической парентеральной стратегии вакцинации применением бустерной вакцины, вводимой перорально до падения титра антител (22). Однако полевые результаты, полученные на нескольких поколениях выращиваемого лосося, не оправдали ожиданий, и эта стратегия не внесла значительного вклада в борьбу с болезнью (1, 25, 29, 38). Внутрибрюшинный путь обычно выбирается для введения вакцин лососю, но об его иммунном ответе известно мало. Недавно было описано значительное увеличение лейкоцитов, общих IgM-антителообразующих клеток (ASC) и специфических к P. salmonis ASC в брюшной полости через 3 и 6 недель после заражения P. salmonis (157). Таким образом, авторы предполагают возможную роль жировой ткани в иммунном ответе брюшной полости.

Микробиом играет важную роль в созревании адаптивной иммунной системы позвоночных и стимуляции иммунного ответа, а также может непосредственно усиливать защиту хозяина от патогенов за счет колонизационной резистентности и продукции ингибирующих соединений (158). Дополнительно, мукозальный иммунный ответ, основанный на IgT+ В-клетках и секретируемом IgT, играет ключевую роль, поскольку IgT сильно индуцируется патогенами на слизистых поверхностях и покрывает большую часть микробиоты рыбы (34, 159, 160). Однако существует важный пробел в отношении того, как дополнить системный иммунитет против P. salmonis достижениями в знаниях об активации местного иммунитета в месте(ах) проникновения P. salmonis, таких как жабры и кожа, а также кишечник, что могло бы помочь ограничить успех инфекции.

Дополнительно, селекция на улучшенную устойчивость к инфекционным заболеваниям является потенциально более устойчивой стратегией для долгосрочного контроля вспышек болезней в аквакультуре (161), особенно когда стратегии вакцинации не были столь эффективны, как ожидалось. Предыдущие исследования продемонстрировали значительную генетическую вариабельность устойчивости к P. salmonis у атлантического лосося (h² = от 0,11 до 0,41), радужной форели (h² = от 0,45 до 0,62) и кижуча (h² = 0,16) с использованием данных о заражении (162–167). Существует важный генетический компонент устойчивости к SRS у атлантического лосося, подтвержденный полигенной архитектурой. При сравнении ответа между рыбой с высокой и низкой устойчивостью к P. salmonis наблюдаются изменения в экспрессии генов, связанных с цитоскелетом, апоптозом и выживанием клеток, бактериальной инвазией/внутриклеточным транспортом и инфламмасомой, которые коррелируют с генетической устойчивостью (168). Таким образом, вероятные механизмы, ведущие к генетической устойчивости, неоднородны и различаются у разных семей и особей.

Один SNP, связанный с развитием В-клеток, был идентифицирован как потенциальный функциональный кандидат, ассоциированный с устойчивостью к P. salmonis, определяемой как время до смерти (162). В-клетки имеют решающее значение в гуморальном иммунном ответе, но они также являются специализированными фагоцитами, поэтому эта последняя врожденная функция может быть важна в иммунном ответе против P. salmonis у кижуча. Ранний рост положительно коррелирует генетически с устойчивостью к P. salmonis, измеряемой временем до смерти и убойным весом у кижуча, поэтому селекция на ранний рост может косвенно улучшить убойный вес и устойчивость к P. salmonis в популяции (169).

Согласно Фигероа и др. (155), междемейная вариабельность является сильным внутренним фактором, определяющим вариабельную защиту вакцин против SRS. В некоторых полносибных семьях дополнительная защита за счет вакцинации увеличивала время выживания по сравнению с их невакцинированными сибсами; в других семьях дополнительной защиты за счет вакцинации не было. Однако необходимы дальнейшие исследования для оценки того, могут ли вариации иммунного ответа хозяина на вакцинацию для борьбы с SRS объяснять различия в устойчивости, наблюдаемые у вакцинированной рыбы, и какие биологические механизмы могут это объяснять, поскольку вакцинация и селекция всегда рассматривались как дополнительные стратегии борьбы с болезнями в аквакультуре. Кроме того, хотя модели заражения через совместное содержание дают мало информации о том, имеют ли рыбы с более высокой генетической устойчивостью и/или вакцинированная рыба меньшую вероятность передачи инфекции при заражении, они являются более подходящими моделями, чем модели внутрибрюшинного заражения, для оценки устойчивости к болезням и/или эффективности вакцин.

Смертность является основным фенотипом устойчивости к болезням у рыб, но появляются доказательства того, что непосредственное нацеливание на выживаемость путем селекции или вакцинации без учета эпидемиологических эффектов не снижает передачу болезни или распространенность заболевания на популяционном уровне (170–172). Три ключевых эпидемиологических признака хозяина влияют на распространенность инфекционных заболеваний и уровень смертности в популяции: восприимчивость, инфекционность и выносливость (170). Чейз-Топпинг и др. (173) сообщили, что как вакцинация, так и генетический отбор снижают, но не предотвращают передачу ISA. Авторы предполагают, что было бы очень полезно оценить комбинированные эффекты генетического отбора и вакцинации на передачу ISA и оценить вирусную нагрузку в слизи как потенциальный in vivo индикатор инфекционности особи. Эти результаты должны быть применены к экспериментам по передаче SRS для понимания эффектов стратегий вакцинации и генетической устойчивости на контроль SRS в полевых условиях. Аналогично, поскольку генетика хозяина и вакцины обеспечивают лишь частичную защиту и вызывают вопросы об их эффективности в полевых условиях, план контроля SRS должен учитывать эпидемиологический аспект, поскольку мало известно о влиянии генетического управления и/или вакцин на передачу и распространенность SRS. Исходя из этого сценария, можно выдвинуть гипотезу о том, что относительный контроль SRS основан на регуляторных и производственных изменениях, разработанных и внедренных отраслью в рамках развивающейся государственно-частной дорожной карты, которая включает стратегии вакцинации, но также и относительно небольшой вклад.

Инфекционные заболевания, вызываемые внутриклеточными бактериями у различных видов выращиваемой рыбы во всем мире, представляют собой большую проблему, особенно для их контроля с помощью вакцинации и генетической устойчивости к болезням. Одним из таких заболеваний является SRS, которое было описано в нескольких странах-производителях лосося, но которое особенно поражает чилийское лососеводство. На практике, учитывая коллективную насущную потребность отрасли в продвижении контроля SRS для повышения ее долгосрочной устойчивости и конкурентоспособности, кажется легкомыслием обсуждать, является ли P. salmonis патогенной или экологической бактерией (174, 175), поскольку в любом случае реальность показывает нам, что: (1) P. salmonis является очень сложной бактерией, о которой нам нужно знать больше, особенно о ее взаимодействии с клетками хозяина; (2) SRS является основным инфекционным заболеванием чилийского лососеводства, ежегодно наносящим экономические потери, консервативно оцениваемые примерно в 700 миллионов долларов; и (3) в среднем 93,28% всех антибиотиков, используемых в чилийской лососевой промышленности за последние 5 лет, было использовано только для борьбы с SRS. Сказанное, несомненно, является главной миссией всех участников лососевой отрасли — продолжать совместную работу по заполнению пробелов в знаниях, которые позволят нам оптимизировать контроль SRS; с особым акцентом на взаимодействие компонентов эпидемиологической триады: патоген, рыба и водная среда (включая управление производством).

В последние годы были получены значительные знания о различных факторах вирулентности P. salmonis, которые могли бы объяснить трудности ее контроля в полевых условиях: (1) Sec-зависимый путь и система секреции типа 4 Dot/Icm; (2) экспрессия белков ClpB и BipA; (3) продукция сидерофоров; (4) гены биосинтеза виброферрина; (5) острова патогенности; (6) мембранные везикулы; (7) крупные криптические плазмиды; (8) Sec-зависимый путь; (9) пили типа IV и биопленки; и (10) экспрессия генов, ассоциированных с вирулентностью, во время строгого ответа, среди прочих. Однако все еще требуются более конкретные знания о механизмах действия факторов вирулентности P. salmonis, которые придают ей высокую способность уклоняться от ответа хозяина. Новые методы в генетике и молекулярной биологии внесли вклад в in vitro изучение базовой биологии P. salmonis. Хотя не все гены патогенных микроорганизмов играют роль в их патогенности или вирулентности, они также не могут быть подтверждены только в модели инвазии в клеточной культуре. Такие методы, как субклеточное фракционирование и сверхразрешающая микроскопия одиночных молекул, должны применяться для маркировки молекул внутри бактерий и клеток хозяина для отслеживания их судьбы во время ранней и поздней инфекции и даже для поиска генов или белков P. salmonis, которые активируются только тогда, когда они находятся внутри клеток.

Хотя эффективный контроль инфекционных заболеваний в аквакультуре требует интеграции нескольких мер управления и вмешательств, существует консенсус в том, что наличие эффективной(ых) вакцины(ин) должно быть одним из важнейших столпов контроля. Однако, хотя есть доказательства того, что усилия были приложены к разработке вакцин против SRS, к сожалению, цель еще не достигнута, и план контроля SRS в основном не имеет эффективной вакцины. Существующие данные показывают, что создание вакцин на основе CMI было бы наиболее эффективным подходом для снижения распространенности и тяжести вспышек SRS. Учитывая, что это один из наиболее вирулентных бактериальных патогенов для лосося, продолжение исследований того, как P. salmonis уклоняется от адаптивных ответов рыбы, необходимо для получения новых знаний, которые улучшат наше понимание взаимодействия хозяина и патогена.

В основном, стратегия разработки эффективных вакцин против P. salmonis должна измениться, начиная с понимания биологических путей, которые бактерия использует для инфицирования и репликации в клетках хозяина, а затем определения стратегий их блокировки. Обычный подход, исторически используемый для разработки вакцин против P. salmonis, не был решением проблемы, поэтому производители лосося не имеют других альтернатив в полевых условиях при столкновении со вспышками SRS, кроме как использовать последнюю доступную карту — химиотерапию. Следовательно, настало время для вакцин нового поколения и обратной вакцинологии в аквакультуре: ДНК-вакцин, мРНК-вакцин, вирусных векторов, мультиэпитопных и мультиантигенных химерных вакцин и других. Однако необходимо генерировать более глубокие и конкретные знания о взаимодействии между P. salmonis и клетками рыбы и, конечно, создавать соответствующие регуляторные механизмы для официальной регистрации этих новых вакцин. Государственные органы, отвечающие за регулирование системы регистрации вакцин и контроль их применения в полевых условиях, должны продвигаться так же быстро, как генерируются новые знания и продукты в результате исследований и инноваций. Неблагоразумно разрабатывать вакцины нового поколения без предварительно созданной регуляторной структуры для авторизации и регулирования их коммерческого использования.

С точки зрения взаимодействия бактерий и клеток хозяина, больше известно об изменениях, индуцируемых P. salmonis в инвазии клеток и внутриклеточном выживании, но мы только начинаем понимать, как иммунная система обнаруживает эти изменения и реагирует на них. Учитывая эти новые данные, возникает несколько важных пробелов: (1) Различается ли роль цитоскелета в клеточно-автономном иммунитете между фагоцитами и эпителиальными клетками? Требуются дальнейшие исследования для определения того, как компоненты цитоскелета в клеточно-автономном иммунитете — актин, микротрубочки, промежуточные филаменты и септины — работают вместе во время инфекции P. salmonis. (2) С иммунологической точки зрения, следует способствовать получению более конкретных знаний для понимания механизмов процессинга и презентации антигенов P. salmonis в АРС, макрофагах и ДК Т-клеткам. Необходимы дальнейшие знания о биологии макрофагов и ДК рыб, чтобы лучше понять, как P. salmonis модулирует их биологию в свою пользу. Препятствует ли P. salmonis презентации своих антигенов через MHC-I? Активируют ли АРС Т-клетки в количестве и качестве, необходимых для обнаружения и элиминации клеток, инфицированных P. salmonis? Как АРС активируют Т-клетки лосося, и как мы можем количественно определить эффективность процесса активации Т-клеток, чтобы считать его защитным ответом? Какова роль В-клеток как фагоцитов и профессиональных антигенпрезентирующих клеток при инфекции P. salmonis? Как можно заблокировать in vivo механизм действия основных факторов вирулентности P. salmonis? Каков мукозальный иммунный ответ против P. salmonis и роль микробиоты? (3) Какова генетическая изменчивость рыб с точки зрения их иммунного ответа против P. salmonis? Как управление генетической устойчивостью и вакцины дополняют друг друга в борьбе с SRS? Почему эти две стратегии не снижают передачу и распространенность SRS? Какие эпидемиологические переменные мы не учитываем в контроле SRS, или каким переменным мы не придаем достаточного значения? Миллионный вопрос останется: будет ли достигнут эффективный контроль SRS, даже если будут разработаны вакцины, запускающие эффективные CMI-ответы? Проблемы индукции CMI-ответов против P. salmonis значительны, как и проблемы, создаваемые другими внутриклеточными патогенами в аквакультуре, такими как Francisella, Renibacterium и Edwarsiella. Важность CMI, которая заключается в продукции естественных клеток-киллеров, CD8+ цитотоксических Т-клеток и CD4+ Th1-клеток, имеет решающее значение для защиты от P. salmonis через правильную активацию мононуклеарных фагоцитов. Стратегии повышения устойчивости к бактерии могут быть сосредоточены на изменении ее модуляции клеточного гомеостаза (цитоскелет, апоптоз или прогрессия клеточного цикла) или усилении иммунных процессов, предотвращающих или замедляющих инфекцию (инфламмасома, распознавание и презентация антигенов, активация и пролиферация Т-клеток, усиление цитотоксической способности CD8+ Т-клеток, окислительный стресс) и других путей. Эти стратегии могут включать нокаут или модуляцию CRISPR/Cas в моделях клеточных линий или, в конечном счете, in vivo для изучения влияния нарушения идентифицированных генов на генетическую устойчивость.

Rozas-Serri M (2022) Why Does Piscirickettsia salmonis Break the Immunological Paradigm in Farmed Salmon? Biological Context to Understand the Relative Control of Piscirickettsiosis. Front. Immunol. 13:856896. doi: 10.3389/fimmu.2022.856896

Перевод статьи «Why DoesPiscirickettsia salmonisBreak the Immunological Paradigm in Farmed Salmon? Biological Context to Understand the Relative Control of Piscirickettsiosis» автора Rozas-Serri M., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык

Фото: wikipedia