Почему гибнут устрицы? Секрет кроется в планктоне, тепле и… иле

Виды рода Vibrio связывают с повторяющимися массовыми гибелями молоди устриц Crassostrea gigas, что создаёт угрозу для мирового устрицеводства. Однако знания об экологии патогенов в пострадавших районах выращивания устриц остаются скудными.

В частности, отсутствуют данные о (i) природных резервуарах популяций вибрионов, патогенных для устриц, (ii) экологических факторах, способствующих их передаче, и (iii) влиянии устрицеводства на сохранение этих патогенов. Этот пробел в знаниях ограничивает нашу способность прогнозировать и предотвращать вспышки заболеваний. Для решения этих вопросов мы проводили мониторинг видов вибрионов, потенциально патогенных для C. gigas, в 2013 и 2014 годах в лагуне Тау — крупном районе устрицеводства на французском средиземноморском побережье. Станции отбора проб были выбраны внутри и за пределами устричных ферм. Ежемесячно измерялись численность и состав сообществ фито-, микрозоо- и мезозоопланктона. Пространственная и временная динамика планктона и видов вибрионов сравнивалась, а положительные корреляции между видами планктона и вибрионами проверялись с помощью ПЦР в реальном времени на изолированных особях планктона. Vibrio crassostreae присутствовала в толще воды в течение обоих лет, тогда как Vibrio tasmaniensis обнаруживалась в основном в 2013 году, а Vibrio aestuarianus не была выявлена никогда. Кроме того, V. tasmaniensis и V. crassostreae обнаруживались как в свободноживущей форме, так и в прикреплённой к планктону через месяц после весенней гибели молоди устриц. В целом, V. crassostreae была связана с температурой и составом планктона, тогда как V. tasmaniensis коррелировала только с составом планктона. Численность видов вибрионов в толще воды была сходной внутри и за пределами устричных ферм, что указывает на значительную пространственную дисперсию патогенов на прилегающих территориях. Примечательно, что в холодные месяцы в донных отложениях устричных ферм было зафиксировано значительное увеличение численности V. tasmaniensis и V. crassostreae. Таким образом, зимний резервуар патогенных вибрионов может вносить вклад в их экологию в этой средиземноморской экосистеме, эксплуатируемой для выращивания моллюсков.

Виды рода Vibrio являются возбудителями эпизоотий, зоонозов и эпидемий (Austin, 2010; Le Roux и др., 2015). За последние два десятилетия штаммы Vibrio aestuarianus и штаммы клады Splendidus связывали с гибелью культивируемых устриц (Soletchnik и др., 1999; Gay и др., 2004; Lemire и др., 2015). В то время как V. aestuarianus известен как основной патоген для взрослых устриц (Travers и др., 2017), штаммы клады Splendidus (Vibrio tasmaniensis и Vibrio crassostreae) ассоциированы с многофакторным заболеванием, поражающим спат и молодь (Gay и др., 2004; Lemire и др., 2015; Bruto и др., 2017; de Lorgeril и др., 2018), которое запускается герпесвирусом OsHV-1 μVar (Segarra и др., 2010; Martenot и др., 2011). Это заболевание, называемое синдромом гибели тихоокеанских устриц, возникает сезонно, когда температура морской воды достигает 16–24°C (Pernet и др., 2012, 2014). Гибель наблюдается в летний сезон на устричных фермах Атлантического побережья Франции, а также весной и осенью на Средиземноморском побережье, для которого характерна более теплая температура морской воды.

Высокоразнообразная клада Splendidus широко распространена в прибрежных морских средах (Pérez-Cataluña и др., 2016). Она включает различные виды вибрионов, некоторые из которых патогенны для устриц (Lemire и др., 2015; Bruto и др., 2017). В настоящее время признано, что обнаружение клады Splendidus, широко используемое в экологических исследованиях (Pernet и др., 2012; Vezzulli и др., 2015), не может считаться показателем распространенности патогенов. В настоящее время оценка риска для видов вибрионов, патогенных для человека, в значительной степени основана на обнаружении факторов вирулентности (Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций/Всемирная организация здравоохранения [ФАО/ВОЗ], 2011), некоторые из которых также были идентифицированы в популяциях клады Splendidus. Например, было показано, что основной порин (OmpU) V. tasmaniensis LGP32 необходим для инвазии гемоцитов, последующего цитолиза и экспрессии вирулентности (Duperthuy и др., 2011; Vanhove и др., 2015, 2016). У V. crassostreae, известные представители которой патогенны для устриц, вирулентность зависит как от геномного региона, обозначаемого как R5 (Lemire и др., 2015), так и от плазмиды вирулентности (Bruto и др., 2017). Недавнее открытие факторов вирулентности у V. tasmaniensis и V. crassostreae позволило проводить более точный мониторинг популяций клады Splendidus, потенциально патогенных для устриц.

В отличие от клады Splendidus, V. aestuarianus вызывает почти клональное заболевание. Штаммы V. aestuarianus, выделенные во время гибели взрослых устриц, в основном патогенны и образуют филогенетически согласованные вирулентные линии, в которых лишь несколько штаммов утратили свою патогенность. Потеря вирулентности в этих редких случаях была связана со сдвигом рамки считывания в регуляторном гене, контролирующем экспрессию металлопротеазы Vam (Goudenège и др., 2015). Вследствие клональности обнаружение dnaJ считается надежным способом идентификации присутствия V. aestuarianus (Saulnier и др., 2009) в окружающей среде.

Хотя гибель молоди устриц неоднократно документировалась в последние годы, нанося значительный урон французскому устрицеводству, экологические движущие факторы повторяемости заболевания изучены слабо. Насколько нам известно, единственное экологическое исследование, изучающее пространственное и временное распределение видов вибрионов клады Splendidus и V. aestuarianus в средиземноморских прибрежных морских системах, было проведено в лагуне Горо, Италия (Vezzulli и др., 2015). В этой лагуне, которая используется для выращивания моллюсков, но не устриц, авторы обнаружили кладу Splendidus, ассоциированную с моллюсками (устрицами и мидиями), планктоном, донными отложениями и морской водой как зимой, так и летом. V. aestuarianus был обнаружен летом и на очень низких уровнях в донных отложениях зимой. Для прогнозирования и предотвращения возникновения заболеваний крайне важно понимать повторяемость синдрома гибели тихоокеанских устриц в морских экосистемах, используемых для устрицеводства. Это требует более глубокого понимания природных резервуаров вибрионов, связанных с заболеванием, и экологических факторов, определяющих их динамику и передачу устрицам.

Настоящее исследование было направлено на изучение сезонной динамики вибрионов, потенциально патогенных для устриц, в лагуне Тау — средиземноморской морской экосистеме со значительной устрицеводческой деятельностью (20% от общей площади). В этой лагуне с 2008 года наблюдаются повторяющиеся массовые гибели молоди устриц (Pernet и др., 2012), вызывающие значительные экономические потери. Ежемесячный мониторинг видов вибрионов проводился в течение 2 лет (2013–2014). Экологические параметры толщи воды измерялись ежемесячно для выявления потенциальных взаимосвязей между численностью вибрионов и фито-, микрозоо- и мезозоопланктоном, температурой и соленостью. Потенциальное влияние устрицеводства на динамику патогенов, сообщества вибрионов и планктона исследовалось в толще воды как внутри, так и за пределами устричных ферм. Мониторинг вибрионов в донных отложениях проводился на обоих участках отбора проб в течение всех четырех сезонов. Результаты показывают, что (i) экология V. crassostreae и V. tasmaniensis подвержена влиянию температуры и/или состава планктона соответственно; и (ii) донные отложения устричных ферм служат зимним резервуаром для патогенных вибрионов.

Район исследования и измерение экологических параметров

Лагуна Тау расположена в регионе Лангедок-Руссийон на юге Франции, вдоль Средиземноморского побережья (Рисунок 1). Она представляет собой крупный мелководный морской водоем (75 км²; глубина <10 м; средняя глубина 4,5 м), соединенный с морем двумя узкими каналами. Эта лагуна является важнейшим французским центром выращивания моллюсков на Средиземноморском побережье. Температура и соленость измерялись еженедельно сетью станций REPHY Ifremer на четырех участках. Два из них, Rephy (N 43°26.058′ и E 003°39.878′) и A9 (N 43°26.340′ и E 003°39.722′), располагались внутри устричных ферм, а два — A5 (N 43°26.832′ и E 003°40.232′) и A3 (N 43°27.222′ и E 003°40.461′) — за пределами устричных ферм (Рисунок 1). Настоящая работа также использовала данные (i) мониторинга весенней гибели спата устриц в лагуне Тау сетью Ifremer RescoII в 2013 и 2014 годах (Réseau d'Observations Conchylicoles [RESCOII], 2014, 2015) и (ii) декларации о гибели молоди устриц в 2014 году, поданные устрицеводами в наблюдательную службу Cepralmar (Centre d'Étude Pour la Promotion des Activités Lagunaires et Maritimes [CEPRALMAR], 2015).

РИСУНОК 1 Расположение и карта лагуны Тау. Места отбора проб (красные точки) расположены внутри (A9 и Rephy) и за пределами (A3 и A5) устричных ферм. Расположение устрицеводческих плотов в пределах ферм обозначено серыми прямоугольниками. Положение морских каналов обозначено звездочкой ∗.

Сбор и фракционирование по размеру проб морской воды

Пробы морской воды отбирались в лагуне Тау ежемесячно с января 2013 года по ноябрь 2014 года. Морская вода отбиралась из подповерхностного слоя (-50 см) с помощью насоса. Участки отбора проб располагались (i) под устричным столом на участках Rephy и A9 и (ii) в 1,5–2 км от устричных столов на участках A3 и A5 (Рисунок 1). Температура и соленость измерялись на каждом участке отбора проб.

Количественный мониторинг вибрионов с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР)

Морская вода была разделена на два размерных класса следующим образом. В одном случае 20 л морской воды фильтровали на лодке через нейлоновую мембрану с размером пор 180 мкм. Затем в лаборатории 500 мл фильтрата пропускали через мембрану MF-Millipore с размером пор 5 мкм (Nucleopore PC 47 мм), а 50 мл полученной жидкости фильтровали через дополнительную мембрану MF-Millipore с размером пор 0,2 мкм, которую сохраняли для дальнейшей экстракции ДНК. Эта мембрана содержала свободноживущие вибрионы размером 0,2–5 мкм. В другом случае 20 л морской воды непосредственно концентрировали через нейлоновый фильтр с размером пор 20 мкм до конечного объема 50 мл. После доставки в лабораторию 0,5 мл концентрата наносили на мембрану MF-Millipore с размером пор 10 мкм. Эта мембрана содержала вибрионы, ассоциированные с частицами планктона размером >20 мкм.

Анализ состава мезозоопланктона

Кратко: 10 м³ морской воды, собранной между A9 и Rephy (внутри устричных столов) и между A3 и A5 (вне устричных столов), непосредственно концентрировали до конечного объема 200 мл с использованием планктонной сети с размером ячеи 63 мкм. Собранный зоопланктон немедленно фиксировали в 4% формальдегиде и хранили при комнатной температуре до проведения идентификации видов с помощью микроскопии. Эта фракция содержала организмы размером >63 мкм.

Анализ состава микрозоопланктона

Десять литров морской воды, собранной внутри (Rephy) и за пределами (A5) устричных ферм, фракционировали на лодке с помощью нейлонового фильтра с размером пор 180 мкм, и 10 мл фильтрата сохраняли в 2% растворе Люголя. В лаборатории образцы хранили при 4°C до проведения идентификации видов с помощью микроскопии. Эта фракция содержала организмы размером <180 мкм.

Анализ состава фитопланктона

Двадцать литров морской воды, собранной в Rephy и A5, непосредственно концентрировали на нейлоновом фильтре с размером пор 20 мкм до конечного объема 50 мл; 10 мл концентрата сохраняли в 2% растворе Люголя и хранили при 4°C до проведения идентификации видов с помощью микроскопии. Эта фракция содержала организмы размером >20 мкм.

Отбор проб поверхностных донных отложений и амплификация бактерий

Образцы кернов донных отложений отбирали в трехкратной повторности в разное время (весна, лето, осень 2014, зима и весна 2015) в точках A5 и Rephy. Затем образцы обрабатывали для подсчета культивируемых вибрионов с использованием метода наиболее вероятного числа/ПЦР (МНЧ-ПЦР) (Machado и Bordalo, 2016); результаты выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ)/г донных отложений. В основном, поверхностные донные отложения каждого керна (0–1 см) использовали для обогащения в бульоне щелочной пептонной воды (ЩПВ) при pH 8,2. Для каждого керна донных отложений от 10 до 10⁻⁴ г (ряд 1:10) донных отложений инокулировали в 10 мл ЩПВ; большее количество (10 г) инокулировали в 100 мл ЩПВ. Инкубацию проводили при 20°C в течение 24 ч. После этого 1 мл каждой культуры в ЩПВ отбирали для экстракции бактериальной ДНК и дальнейшего обнаружения V. aestuarianus, V. tasmaniensis и V. crassostreae с помощью кПЦР, как описано ниже.

Экстракция ДНК и мониторинг вибрионов с помощью кПЦР

ДНК из фракций толщи воды (>20 и 0,2–5 мкм) экстрагировали с использованием набора Macherey Nagel Nucleospin tissue. ДНК ресуспендировали в 100 мкл воды и хранили при -20°C. Для образцов донных отложений, культивированных в ЩПВ, ДНК экстрагировали из 1 мл культуральной среды с использованием набора Wizard Genomic DNA Purification (Promega). Количественная ПЦР в реальном времени использовалась для мониторинга численности вибрионов с использованием пар праймеров, разработанных для амплификации однокопийных генов, связанных с вирулентностью у V. tasmaniensis (ompU), V. crassostreae (R5-2) или V. aestuarianus (dnaJ) (Таблица 1). Видоспецифичные праймеры для вибрионов (16S рРНК) использовались для определения общей численности вибрионов (Таблица 1). Реакции кПЦР проводили на приборе LightCycler 480 (Roche Diagnostics). Обычно реакции содержали 1 мкл матричной ДНК (в концентрациях 1–40 мкг/мл), 1 мкл каждого праймера (3,33 мкМ) и 3 мкл реакционной смеси (SYBR Green Master Mix) в общем объеме 6 мкл. Параметры реакции были следующими: 5 мин при 95°C (начальная денатурация) и 40 циклов: 10 с при 95°C (денатурация); 10 с при 65°C (R5-2), 62°C (ompU и 16S рРНК) или 60°C (dnaJ) (гибридизация); и 10 с при 72°C (элонгация). Профили кривых плавления генерировали путем повышения температуры от 65 до 95°C со скоростью 0,5°C в секунду. Продукты амплификации анализировали с использованием программного обеспечения LightCycler (Roche Diagnostics).

Таблица 1 Последовательности праймеров, используемых для амплификации в кПЦР.

Количественная оценка микроорганизмов достигалась путем построения калибровочных кривых с использованием ДНК, выделенной из референтных штаммов (V. tasmaniensis LGP32, V. crassostreae J2-9 и V. aestuarianus Ifremer LPI 02/41) (Дополнительный рисунок S1). Для построения стандартных кривых логарифмическое значение концентрации ДНК вибрионов наносили на график относительно значения порогового цикла (Cp), как предложено в Руководстве оператора LightCycler 480 2008 (Дополнительный рисунок S1). Специфичность и эффективность праймеров были проверены на ДНК, экстрагированной из неисчерпывающего списка из 21 таксономически разнообразного штамма вибрионов (Дополнительная таблица S1). Количество бактериальных клеток на литр морской воды определяли по числу амплифицированных копий однокопийных генов. Взаимосвязь между концентрацией ДНК и числом бактериальных геномов рассчитывали с использованием размера генома референтных штаммов, использованных для построения стандартных кривых (4,98 Мbp для V. tasmaniensis LGP32, 5,79 Мbp для V. crassostreae J2-9 и 4,19 Мbp для V. aestuarianus 02_041).

Оценка ассоциаций планктон/вибрионы in situ

Кандидатные виды планктона, идентифицированные как совместно встречающиеся с вибрионами по данным статистического анализа (т.е. виды планктона, показывающие статистически значимые межвидовые взаимосвязи с патогенными вибрионами, обнаруженными во фракции >20 мкм), были вручную изолированы из фиксированных формалином образцов мезозоопланктона, собранных во время нашего полевого отбора проб. ДНК экстрагировали из образцов (пулы особей, принадлежащих к одним и тем же таксонам) в выбранные даты, после чего с помощью кПЦР определяли наличие вибрионов (см. выше). Отрицательные контроли включали ДНК, экстрагированную из образца мезозоопланктона, присутствующего в тех же пробах, но принадлежащего к таксонам, которые не показывали значимой корреляции с численностью вибрионов.

Статистический анализ

Для исследования взаимосвязи между численностью вибрионов (16S рРНК) и экологическими переменными был проведен анализ главных компонент на экологических данных за каждый год. Перед анализом данные были стандартизированы к среднему значению 0 и единичной дисперсии. Два главных компонента были сохранены для оценки потенциальных движущих факторов численности Vibrio spp. Кроме того, для выяснения относительной важности экологических переменных в определении общей численности Vibrio spp. мы использовали данные для построения общей линейной модели. Вибрионы, обнаруженные во фракции >20 мкм и во фракции 0,2–5 мкм, анализировались отдельно. Данные анализировались по годам (станции A5 и Rephy рассматривались совместно). Предикторы, проверенные в модели общей численности Vibrio spp., включали параметры, известные как важные для динамики Vibrio spp. (температура, соленость), или те, которые служили индикаторами поступления планктона (общая численность фитопланктона и зоопланктона, общая численность ресничных и жгутиковых). Данные были нормализованы и логарифмически преобразованы.

Для исследования межвидовых взаимосвязей между патогенными вибрионами и планктоном рассматривались только виды вибрионов, обнаруженные во фракции >20 мкм. Станции A5 и Rephy анализировались совместно. Виды планктона с низкой частотой обнаружения (т.е. реже трех раз в год) были исключены из анализа. Данные были нормализованы и логарифмически преобразованы.

Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения Statistica (v12.0). Для статистического анализа между концентрациями вибрионов в донных отложениях, температурой и соленостью рассчитывались параметрические корреляции с использованием программного обеспечения XLStat-Base.

Весенняя и осенняя гибель молоди устриц в лагуне Тау

В течение двух последовательных лет (2013–2014) на четырех участках, расположенных внутри (Rephy и A9) и за пределами (A5 и A3) устричных ферм в лагуне Тау, характеризующихся массовой гибелью спата и молоди устриц, проводились исследования. Оба года показали схожие тенденции в температуре и солености морской воды (Дополнительный рисунок S2). В 2013 году были спрогнозированы два периода риска гибели продолжительностью по два месяца каждый — в мае–июне и сентябре–октябре, когда температура морской воды находилась в диапазоне 16–24°C (Дополнительный рисунок S2). В 2014 году период риска гибели расширился с апреля по октябрь, исключая только август. Гибель спата устриц происходила в прогнозируемые периоды риска, что было показано как сетью мониторинга Ifremer RescoII, так и заявлениями устрицеводов в Cepralmar (Дополнительный рисунок S2). Гибель устриц не могла быть отслежена осенью 2013 года, поскольку в лагуне RescoII содержались только сторожевые животные, пережившие весеннюю гибель (т.е. особи, устойчивые к заболеванию) (Pernet и др., 2012).

Различная динамика вибрионов, потенциально патогенных для устриц, в толще воды

Для мониторинга годовой динамики вибрионов в толще воды пробы морской воды отбирались ежемесячно как внутри (Rephy и A9), так и за пределами устричных ферм (A5 и A3) в течение двух лет. Все пробы были положительными на общие вибрионы (16S рРНК), что свидетельствует о высокой распространенности вибрионов в лагуне Тау как в виде свободноживущих (0,2–5 мкм), так и ассоциированных с планктоном (>20 мкм) бактерий (Рисунки 2, 3). В целом, численность общих вибрионов в толще воды слабо зависела от места отбора проб, но была на два порядка ниже в 2014 году по сравнению с 2013 годом (Рисунки 2, 3).

РИСУНОК 2 Ежемесячная численность свободноживущих вибрионов в толще воды. Гистограммы показывают кажущиеся концентрации вибрионов, основанные на амплификации в кПЦР (16S рРНК, ompU и R5-2) ДНК, экстрагированной из фракции 0,2–5 мкм толщи воды. Пробы отбирались за пределами устрицеводческой зоны (A3, серые столбцы и A5, белые столбцы) и внутри устричной фермы (A9, штрихованные белые столбцы и Rephy, штрихованные черные столбцы). Средняя температура морской воды (°C) обозначена красной линией. н/о — не определялось.

РИСУНОК 3 Ежемесячная численность ассоциированных с планктоном вибрионов в толще воды. Гистограммы показывают кажущиеся концентрации вибрионов, основанные на амплификации в кПЦР (16S рРНК, ompU и R5-2) ДНК, экстрагированной из фракции >20 мкм толщи воды. Пробы отбирались за пределами устрицеводческой зоны (A3, серые столбцы и A5, белые столбцы) и внутри устричной фермы (A9, штрихованные белые столбцы и Rephy, штрихованные черные столбцы). Средняя температура морской воды (°C) обозначена красной линией. н/о — не определялось.

Вибрионы, потенциально патогенные для устриц, демонстрировали различную экологическую динамику в лагуне Тау на основе кажущихся концентраций, определенных с помощью кПЦР. V. crassostreae (R5-2) был рекуррентным в толще воды в 2013–2014 годах; в теплые месяцы он обнаруживался как в виде свободноживущих (3,8 × 10⁵–1,1 × 10⁷ клеток/л), так и ассоциированных с планктоном вибрионов (1,3–8,9 × 10⁵ клеток/л) (Рисунки 2, 3). В целом, V. crassostreae был примерно в 100 раз более многочисленным в 2013 году, чем в 2014 году (Рисунки 2, 3). V. tasmaniensis (ompU) обнаруживался почти исключительно в 2013 году: свободноживущие V. tasmaniensis обнаруживались с весны до осени (преимущественно в мае, июне и ноябре, в концентрации 2,4 × 10⁶–1,2 × 10⁸ клеток/л; Рисунок 2), тогда как ассоциированные с планктоном V. tasmaniensis обнаруживались в течение большей части года в концентрации 4,4 × 10⁴–6,3 × 10⁵ клеток/л (Рисунок 3). В целом, обнаружение свободноживущих V. crassostreae и/или V. tasmaniensis в толще воды начиналось в основном весной (май–июнь), через месяц после начала весенней гибели (Рисунок 2). V. aestuarianus (dnaJ) не был обнаружен в течение двух исследуемых лет (данные не показаны).

Контрастная годовая и пространственная динамика фито- и зоопланктона в лагуне Тау

Для выявления экологических взаимодействий между потенциально патогенными для устриц вибрионами и видами планктона, которые могли бы определять их динамику в толще воды, мы определяли ежемесячную численность таксонов планктона в толще воды в течение двух лет на обоих участках отбора проб (Рисунок 4). Во-первых, результаты, полученные для видов мезозоопланктона (>63 мкм), демонстрировали схожую тенденцию в течение двух лет, с максимальной численностью в теплые месяцы. Общая численность была до четырех раз выше в 2013 году, чем в 2014 году за пределами устричных ферм (A5) (Рисунки 4A, C). Хотя численность мезозоопланктона была значительно (до 20 раз) выше за пределами (A5), чем внутри устричных ферм (Rephy), общий состав мезозоопланктона (27 таксонов) существенно не различался между участками: виды мезозоопланктона, науплии копепод и Oithona sp. (копепода) преобладали на всех участках. Также наблюдалась большая доля личинок двустворчатых моллюсков, особенно в феврале–марте 2013 года (Дополнительный рисунок S3). Основные различия между участками наблюдались в марте 2013 года с доминированием Polychaeta за пределами устричных ферм по сравнению с двустворчатыми и копеподами внутри ферм. В целом, 2014 год отличался от 2013 года главным образом более высоким вкладом копепод родов Acartia и Paracartia в общую численность мезозоопланктона (Дополнительный рисунок S3).

РИСУНОК 4 Ежемесячная численность общего мезозоопланктона и фитопланктона. (A, B) 2013 и (C, D) 2014 ежемесячные значения численности планктона за пределами (A5, белые столбцы) и внутри устричных ферм (Rephy, черные столбцы). Общая численность мезозоопланктона (особей/м³) показана на (A, C). Общая численность фитопланктона (клеток/л) показана на (B, D). н/о — не определялось.

Микрозоопланктон (<180 мкм), состоящий из ресничных (n = 23 таксона) и тинтиннид (n = 20 таксонов), собирался в толще воды только в 2014 году (в 2013 году отбор не проводился). Ресничные присутствовали на обоих участках со схожей динамикой, при этом Leprotintinnus sp. и Mesodinium rubrum были наиболее часто идентифицируемыми таксонами (Дополнительный рисунок S4). Тинтинниды демонстрировали контрастную динамику между двумя участками, особенно осенью и зимой (Дополнительный рисунок S4). Основные различия наблюдались для Helicostomella subulata, Tintinnopsis sp. и Salpingella sp. (Дополнительный рисунок S4).

Численность фитопланктона (>20 мкм) была примерно в пять раз выше в 2013 году, чем в 2014 году (Рисунки 4B, D). Более того, между годами наблюдался сильно контрастный состав фитопланктона, что было определено путем таксономической идентификации 47 таксонов (Дополнительный рисунок S5). В 2013 году наиболее часто встречаемыми таксонами были диатомовая водоросль Skeletonema costatum и динофлагелляты Gymnodinium sp., Gonyaulax sp. и Scrippsiella trochoidea; тогда как в 2014 году доминировали диатомовая Chaetoceros sp. и динофлагелляты Protoperidinium sp. и Alexandrium sp. (Дополнительный рисунок S5). Состав фитопланктона также варьировал в зависимости от участка отбора проб в 2013 году (Дополнительный рисунок S5).

Сообщества планктона играют важную роль в динамике общих вибрионов в лагуне Тау

Корреляции между общими вибрионами (16S рРНК), численностью фито- и зоопланктона, температурой и соленостью анализировались с использованием данных, полученных в ходе исследования 2013–2014 годов. Ни один из этих параметров не вносил существенного вклада в годовую динамику свободноживущих вибрионов (Рисунки 5A, B). Вместо этого они значительно влияли на ассоциации вибрионов с видами планктона, что отражает заметные различия в экологических условиях между двумя исследуемыми годами (Рисунок 5A). В 2013 году общий фитопланктон был единственной переменной, объясняющей численность вибрионов во фракции >20 мкм (ассоциированные с планктоном вибрионы), как показано общей линейной моделью (Рисунок 5B). Напротив, в 2014 году численность ассоциированных с планктоном вибрионов была полностью разобщена с фитопланктоном, при этом не было определено значимой корреляции с другими вносящими вклад параметрами, такими как зоопланктон и температура (Рисунки 5A, B). Эти данные предполагают, что некоторые виды планктона, которые встречаются не ежегодно, играют важную роль в обеспечении ассоциации вибрионов с планктоном. В соответствии с нашими результатами по общему фитопланктону, большинство значимых положительных корреляций (p < 0,05) между видами фитопланктона и ассоциированными с планктоном вибрионами (16S рРНК) было выявлено в 2013 году. Так, в 2013 году ассоциированные с планктоном вибрионы коррелировали с численностью пяти видов: динофлагеллят Gonyaulax sp., Gonyaulax spinifera и Protoperidinium sp., а также диатомовых Tripos furca и Pseudonitzschia sp. (r = 0,568, r = 0,665, r = 0,685, r = 0,516 и r = 0,596 соответственно; Таблица 2). Интересно, что в 2014 году, который отличался от 2013 года совершенно иным составом фитопланктона, значимые положительные корреляции наблюдались только с диатомовой Pseudonitzschia sp. (r = 0,493; Таблица 2). В соответствии с важной ролью фитопланктона только в 2013 году, таксоны фитопланктона, показавшие значимые положительные корреляции с численностью вибрионов в 2013 году, были гораздо менее распространены в 2014 году.

РИСУНОК 5 Взаимосвязи между численностью общих вибрионов и экологическими параметрами. (A) Анализ главных компонент экологических данных за 2013–2014 годы: Температура, Соленость, Общий зоопланктон, Общий фитопланктон, Ассоциированные с планктоном вибрионы (фракция >20 мкм), Свободноживущие вибрионы (фракция 0,2–5 мкм). Для 2014 года также представлены данные по ресничным (микрозоопланктон), разделенные на два типа организмов: безраковинные и тинтинниды. (B) Результаты общей линейной модели, показывающие относительную важность экологических переменных для численности ассоциированных с планктоном вибрионов (16S рРНК во фракции >20 мкм) и свободноживущих вибрионов (фракция 0,2–5 мкм). Результаты, выделенные жирным шрифтом, указывают на значимое (p < 0,05) влияние переменной.

Таблица 2 Корреляции между видами вибрионов и планктона в толще воды.

Корреляции (p-значения < 0,05) между численностью видов вибрионов и фитопланктона, микрозоопланктона и мезозоопланктона в соответствии с размерным классом в ходе программы полевого мониторинга за оба года (2013 и 2014). Мониторинг микрозоопланктона проводился только в 2014 году.

Значимые положительные корреляции (p < 0,05) между общими вибрионами и сообществом мезозоопланктона возникали в основном в 2013 году, который характеризовался более высокой численностью планктона. Ассоциированные с планктоном вибрионы положительно коррелировали с копеподой Oncaea venusta (r = 0,555) в 2013 году. Копепода Pseudocalanus sp. и личинки асцидий, присутствовавшие в толще воды только в 2014 году, показали значимую положительную корреляцию с ассоциированными с планктоном вибрионами (r = 0,540 и r = 0,595 соответственно; Таблица 2). Корреляции между численностью видов микрозоопланктона анализировались только в 2014 году, поскольку в 2013 году отбор проб не проводился. Значимая положительная корреляция наблюдалась между ассоциированными с планктоном вибрионами и ресничной Tiarina fusus (r = 0,472, p < 0,05; Таблица 2).

Патогенные вибрионы демонстрируют контрастные ассоциации с видами планктона и абиотическими параметрами

Численность патогенных вибрионов в толще воды сравнивалась как с биотическими, так и с абиотическими параметрами, измеренными в лагуне Тау. Среди двух исследованных патогенных популяций только V. crassostreae (R5-2) показал положительную корреляцию с температурой как в ассоциированном с планктоном, так и в свободноживущем состоянии. В частности, ассоциированные с планктоном V. crassostreae положительно коррелировали с температурой в 2013 году (r = 0,503, p < 0,05). Более того, свободноживущие V. crassostreae сильно коррелировали с температурой (r = 0,849, p < 0,05) и соленостью (r = 0,862, p < 0,05) в 2014 году. Напротив, значимой корреляции между численностью V. tasmaniensis (ompU), температурой и/или соленостью обнаружено не было.

Ассоциации с видами фитопланктона

Обе патогенные популяции демонстрировали различные ассоциации с видами фитопланктона. Значимые положительные корреляции (p < 0,05) были обнаружены между ассоциированными с планктоном V. tasmaniensis и диатомовой Chaetoceros sp. (r = 0,601). Напротив, ассоциированные с планктоном V. crassostreae показали положительные корреляции с динофлагеллятами G. spinifera (r = 0,487) и S. trochoidea (r = 0,558), обнаруженными в основном в 2013 году (Дополнительный рисунок S5), и диатомовой Pseudonitzschia sp. (r = 0,503) (Таблица 2).

Ассоциации с видами мезозоопланктона

Значимые положительные корреляции с видами мезозоопланктона различались в зависимости от вида вибрионов и были очевидны в основном в 2013 году. Ассоциированные с планктоном V. tasmaniensis коррелировали с численностью книдария Obelia sp. (r = 0,697, p < 0,05), тогда как ассоциированные с планктоном V. crassostreae коррелировали с численностью копепод Centropages sp. (r = 0,733, p < 0,05) и Euterpina sp. (r = 0,542, p < 0,05), а также аппендикулярии Oikopleura dioica (r = 0,482, p < 0,05) (Таблица 2). Как и для фитопланктона, меньшее число видов мезозоопланктона коррелировало с патогенными видами вибрионов в 2014 году (Дополнительный рисунок S3).

Ассоциации с видами микрозоопланктона

Корреляции между численностью видов микрозоопланктона и ассоциированными с планктоном патогенными видами вибрионов анализировались только в 2014 году, поскольку в 2013 году отбор проб не проводился. Эти анализы проводились только для V. crassostreae из-за отсутствия обнаружения V. tasmaniensis в образцах 2014 года. Результаты не показали значимой корреляции между V. crassostreae и видами микрозоопланктона (Таблица 2).

Ассоциация Vibrio tasmaniensis с книдарием Obelia sp.

Далее мы проверили, являются ли таксоны планктона, численность которых коррелировала с численностью Vibrio spp., ПЦР-положительными на патогенные вибрионы. Мы изолировали особи Obelia sp., Centropages sp. и O. dioica из ПЦР-положительных образцов и провели ПЦР-детекцию на изолированных образцах. В качестве отрицательного ПЦР-контроля (детекция не ожидалась) мы использовали образцы аннелид, изолированные из наших ПЦР-положительных полевых образцов, поскольку их временная динамика не показывала положительной корреляции ни с одним видом вибрионов, потенциально патогенных для устриц. Образцы анализировали с использованием праймеров 16S рРНК, ompU, R5-2 и dnaJ. Все изолированные особи были положительны по 16S рРНК, что указывает на то, что виды вибрионов были ассоциированы с широким числом видов планктона (Дополнительная таблица S2). Мы не смогли подтвердить взаимодействия V. crassostreae с Centropages sp. и Oikopleura sp., вероятно, из-за ограниченного числа изолированных особей. Однако, в соответствии с нашими статистическими анализами за 2013 год, ПЦР, проведенная на Obelia sp., была положительной на V. tasmaniensis, но не на V. crassostreae и не на V. aestuarianus (Дополнительная таблица S2).

Донные отложения как возможный зимний резервуар V. tasmaniensis и V. crassostreae на устричных фермах

Чтобы определить, могут ли другие compartments, кроме толщи воды, такие как донные отложения, служить резервуаром для видов вибрионов, потенциально патогенных для устриц, мы отбирали донные отложения на основных исследуемых участках (Rephy и A5) в течение всех четырех сезонов (пять отборов проб с мая 2014 года по апрель 2015 года). V. tasmaniensis (0,04–110 КОЕ МНЧ/г) и V. crassostreae (4–50 КОЕ МНЧ/г) были малочисленны в донных отложениях за пределами устричных ферм (A5) (Рисунок 6). Напротив, донные отложения устричных ферм (Rephy) содержали заметно более высокие уровни обеих патогенных популяций осенью (1,1 × 10³ КОЕ МНЧ/г) и зимой (2 × 10³ и 1,1 × 10⁴ КОЕ МНЧ/г для V. tasmaniensis и V. crassostreae соответственно) (Рисунок 6). Как V. tasmaniensis, так и V. crassostreae показали значительное снижение в донных отложениях летом, независимо от исследуемой станции. Статистический анализ выявил значимую отрицательную корреляцию между численностью V. tasmaniensis и температурой на станции Rephy (r = 0,915, p < 0,05). Аналогичная тенденция наблюдалась для V. crassostreae на станции Rephy, но корреляция не была значимой (r = 0,795, p > 0,05).

РИСУНОК 6 Сезонная численность вибрионов в донных отложениях. Средняя концентрация Vibrio tasmaniensis и Vibrio crassostreae (КОЕ МНЧ/г) в поверхностных донных отложениях, собранных за пределами устрицеводческой зоны (A5, белый столбец) и внутри устричной фермы (Rephy, черные столбцы). Средняя температура подповерхностной морской воды (°C) обозначена красной линией.

Настоящее исследование сообщает об экологической динамике видов вибрионов, потенциально ассоциированных с синдромом гибели тихоокеанских устриц, в средиземноморской лагуне, интенсивно используемой для устрицеводства. Путем мониторинга как общих вибрионов, так и потенциальных патогенных видов в течение двух лет (2013–2014), характеризующихся массовой гибелью молоди устриц, мы смогли идентифицировать важные параметры, влияющие на их экологию, а также потенциальные природные резервуары. Мы также смогли исследовать влияние устрицеводства на циклы патогенов.

Наше двухгодичное исследование выявило, что виды вибрионов постоянно присутствовали в лагуне Тау как в виде свободноживущих, так и ассоциированных с планктоном бактерий во всех фракциях толщи воды в течение 2013–2014 годов. Однако виды вибрионов демонстрировали контрастную численность в течение двух лет, которые в остальном характеризовались схожими температурными тенденциями. Действительно, клетки вибрионов были примерно в 100 раз более многочисленными в 2013 году, чем в 2014 году. В целом, годовая динамика общих Vibrio spp. не коррелировала с температурой, что поддерживает недавние выводы Vezzulli и др. (2015) в другой средиземноморской лагуне. Вместо этого уровни фито- и зоопланктона, которые были намного выше в 2013 году, чем в 2014 году, коррелировали с численностью вибрионов, что предполагает, что они могут способствовать увеличению численности вибрионов в толще воды. Несколько исследований показали тесную взаимосвязь между структурой сообщества планктона и численностью вибрионов (Asplund и др., 2011; Main и др., 2015). Наши результаты демонстрируют, что взаимодействия между вибрионами и видами планктона зависели не только от численности планктона, но и от конкретных таксонов, присутствующих в толще воды.

Виды вибрионов, потенциально патогенные для устриц, были многочисленны в толще воды лагуны Тау через месяц после основных эпизодов гибели спата. В частности, V. tasmaniensis и V. crassostreae из клады Splendidus, которая составляет большую долю патогенных штаммов (Gay и др., 2004; Bruto и др., 2017), обнаруживались на значимых уровнях в толще воды. Наивысшая концентрация патогенных видов вибрионов достигала 10⁷ клеток/л морской воды, что в 15 раз превышает концентрации, сообщенные для всей клады Splendidus в лагуне Горо (Италия), которая не используется для устрицеводства (Vezzulli и др., 2015). Заманчиво предположить, что патогены высвобождаются самими устрицами в результате заболевания, хотя другие экологические резервуары также могут вносить вклад в цикл патогенов. Примечательно, что различий в численности каждого из этих потенциально патогенных вибрионов между участками отбора проб, расположенными внутри и за пределами устричных ферм (на расстоянии 1,5–2 км), обнаружено не было. Это соответствует предыдущим данным, показывающим, что заболевание (измеряемое по гибели устриц) легко и быстро передается от участка к участку в лагуне Тау в ходе эпизоотического процесса локальной передачи (Pernet и др., 2014). Наши данные дополнительно указывают на то, что патогенные вибрионы быстро рассеиваются как в виде свободноживущих, так и ассоциированных с планктоном популяций не только от фермы к ферме, но и за пределы устрицеводческих зон. Такое рассеивание, вероятно, опосредовано как гидродинамической связностью лагуны Тау (Lazure и Dumas, 2008; Fiandrino и Verney, 2010), так и собственной подвижностью вибрионов, которая позволяет им распространяться в благоприятные среды и/или уходить из неблагоприятных (Zhu и др., 2013). Среди трех исследованных патогенов только V. aestuarianus не был обнаружен в течение двух лет, что предполагает низкую распространенность этого вида в лагуне Тау.

Было обнаружено, что на экологию видов вибрионов, потенциально патогенных для устриц, влияют различные экологические движущие факторы. Численность V. crassostreae в толще воды коррелировала с температурой, что согласуется с предыдущими исследованиями, показавшими, что соленость и температура коррелируют с численностью вибрионов (Thompson и др., 2004; Turner и др., 2009; Wendling и Wegner, 2013). Интересно, что среди двух потенциальных патогенов, присутствующих в лагуне Тау, только V. crassostreae неоднократно наблюдался как в свободноживущем, так и в ассоциированном с планктоном состоянии в теплые месяцы 2013 и 2014 годов (с мая по сентябрь). Напротив, V. tasmaniensis обнаруживался в основном в 2013 году, ведя свободноживущий образ жизни в теплые месяцы (май–август), будучи при этом ассоциированным с планктоном в течение всего года. Хотя температура и соленость часто объясняют большую часть вариаций численности вибрионов, чем любой другой водный параметр, Takemura и др. (2014) показали, что такие тенденции не обязательно применимы к видам вибрионов в природной среде. Переключение между свободноживущим и ассоциированным с планктоном образом жизни, наблюдаемое для V. tasmaniensis, предполагает важный вклад состава планктона в его динамику в толще воды. Наши данные предполагают, что динамика популяций V. tasmaniensis может существенно зависеть от взаимодействий между V. tasmaniensis и книдарием Obelia sp. Таким образом, из нашего исследования следует, что динамика V. crassostreae в лагуне Тау определяется как температурой, так и составом планктона, тогда как динамика V. tasmaniensis определяется только последним. Это согласуется с предыдущими сообщениями о том, что на взаимодействие между вибрионами и видами планктона влияют изменения в структуре и численности сообщества планктона (Main и др., 2015) и что таксоны планктона являются важными факторами, объясняющими численность вибрионов (Takemura и др., 2014).

Оба патогенных вида вибрионов, V. crassostreae и V. tasmaniensis, были обильны на широком спектре планктонных хозяев (>20 мкм), включая виды копепод, ресничных, книдарий, оболочников, диатомовых и динофлагеллят. Хотя они, вероятно, не инфицируют напрямую эти виды, патогенные вибрионы могут прикрепляться к их поверхности и вести себя как патогены с множеством хозяев. Эти ассоциации могут значительно способствовать передаче. Действительно, устрицы питаются крупными частицами легче, чем свободноживущими бактериями (Dupuy и др., 2000). Более того, мы наблюдали, что устрицеводство оказывает сильное негативное влияние на численность планктона, скорее всего, как следствие фильтрационной активности устриц. Следовательно, прикрепление патогенных видов вибрионов к таксонам планктона может существенно увеличить скорость передачи устрицам, как было предложено для передачи Vibrio cholerae человеку (Rawlings и др., 2007). Ассоциация с живыми организмами также известна как одна из основных стратегий выживания для видов вибрионов, которая позволяет им сохраняться в пелагической среде (Dawson и др., 1981). С эволюционной точки зрения это предполагает, что виды вибрионов, патогенные для устриц, выработали механизмы прикрепления к планктону, которые не только способствуют сохранению в окружающей среде, но и обеспечивают их эффективную передачу и инфекционность. Имеет ли значение использование одних и тех же адгезинов на разных стадиях или в разных средах, имеет первостепенное значение для понимания возникновения патогенов.

Примечательно, что здесь донные отложения были идентифицированы как потенциальный зимний резервуар V. tasmaniensis и V. crassostreae на устричных фермах лагуны Тау. Действительно, заметное увеличение численности V. tasmaniensis и V. crassostreae наблюдалось в донных отложениях под устричными столами осенью и зимой. Наши полевые данные показывают, что высокие температуры оказывают негативное влияние на численность V. tasmaniensis как в донных отложениях, так и в толще воды. Это согласуется с Vezzulli и др. (2015), которые наблюдали (i) высокие количества клеток вибрионов в донных отложениях лагуны Горо зимой и (ii) лучшее сохранение V. tasmaniensis LGP32 при 5°C, чем при 25°C. Поскольку численность вибрионов за пределами устричных столов в лагуне Тау оставалась низкой в течение всего исследуемого периода, устрицеводство, по-видимому, активно обогащает донные отложения патогенными вибрионами. Это, вероятно, связано с массовой гибелью, наблюдаемой весной и осенью, и последующим осаждением бактерий в донных отложениях этой мелководной зоны (<4 м). Таким образом, зимой донные отложения под устричными столами могут способствовать сохранению устричных патогенов в лагуне Тау. Мы выдвигаем гипотезу, что вибрионы находят там источник питательных веществ и/или устанавливают биотические взаимодействия с бентосными организмами, которые благоприятствуют их жизнеспособности и росту. Вероятно, что высокая численность патогенов в поверхностных донных отложениях служит источником для заселения толщи воды при ресуспензии, как было продемонстрировано для нейротоксичной цистообразующей динофлагелляты Alexandrium catenella (Genovesi и др., 2013) в лагуне Тау. Это открытие заслуживает особого внимания с точки зрения управления устрицеводством. Действительно, обычные практики, такие как увеличение биомассы устриц для компенсации гибели, могут оказывать значительное воздействие, способствуя обсеменению донных отложений устричных ферм патогенными вибрионами, тем самым поддерживая циклы патогенов в этой интенсивно эксплуатируемой морской экосистеме.

Таким образом, настоящее исследование предоставляет новые полевые данные для выявления эпидемиологических закономерностей, связанных с динамикой сообщества вибрионов, особенно видов, патогенных для тихоокеанской устрицы C. gigas. Наши результаты показывают, что устрицеводство вносит вклад в жизненный цикл патогенов, в частности через донные отложения устричных ферм, в которых зимой было обнаружено обилие патогенных вибрионов. Соответственно, донные отложения могут служить важным резервуаром-источником. Хотя патогены спорадически обнаруживались в толще воды зимой, вероятно, при ресуспензии донных отложений, они процветали в основном при повышении температуры, после начала эпизодов гибели устриц. Различия в численности и составе планктона и вибрионов в течение двух исследуемых лет выявили сложность экологии патогенов в этой средиземноморской экосистеме. Поскольку существует значительный экономический интерес к выявлению факторов, определяющих экологию патогенных вибрионов, выводы из настоящей работы должны быть подкреплены крупномасштабным мониторингом лагуны Тау. Это должно включать мониторинг патогенов и состава планктона в течение большего числа лет и по всей лагуне с учетом гидродинамических свойств экосистемы. Поскольку патогенность вибрионов не зависит от единичных молекулярных детерминант, которые, кроме того, могут быть общими для различных патогенных популяций, как недавно было показано Bruto и др. (2018), специфические инструменты для точного мониторинга патогенов все еще отсутствуют. Поэтому в будущем придется рассмотреть возможность выделения, генотипирования и фенотипирования штаммов вибрионов, ассоциированных с различными экологическими compartments в исследуемой морской экосистеме.

Дополнительные материалы к этой статье можно найти онлайн по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.02530/full#supplementary-material

1.http://wwz.ifremer.fr/observatoire_conchylicole

2.http://wwz.ifremer.fr/lerpc/Activites-et-Missions/Surveillance/REPHY

Lopez-Joven C, Rolland J-L, Haffner P, Caro A, Roques C, Carré C, Travers M-A, Abadie E, Laabir M, Bonnet D and Destoumieux-Garzón D (2018) Oyster Farming, Temperature, and Plankton Influence the Dynamics of Pathogenic Vibrios in the Thau Lagoon. Front. Microbiol. 9:2530. doi: 10.3389/fmicb.2018.02530

Перевод статьи «Oyster Farming, Temperature, and Plankton Influence the Dynamics of Pathogenic Vibrios in the Thau Lagoon» авторов Lopez-Joven C, Rolland J-L, Haffner P, Caro A, Roques C, Carré C, Travers M-A, Abadie E, Laabir M, Bonnet D and Destoumieux-Garzón D., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык

Фото: wikipedia