Три метода инокуляции вирусных векторов в растения

Сельское хозяйство сталкивается с новыми вызовами: глобальное потепление изменяет условия выживания сельскохозяйственных культур, а на горизонте появляются новые вредители. Чтобы идти в ногу с этими вызовами, доставка генов предоставляет инструменты для повышения урожайности. С другой стороны, доставка генов также открывает возможности для молекулярного фермерства — производства фармацевтических препаратов в растениях. Однако на пути к увеличению производства продуктов питания и масштабируемому молекулярному фермерству остаются технические трудности и нормативные барьеры, которые необходимо преодолеть.

Отраслевым стандартом является трансформация растений с помощью Agrobacterium tumefaciens, но этот метод ограничен определенными видами растений, требует организации помещений для выращивания растений и ферментации бактерий, а также вносит в систему загрязнения липополисахаридами. Поэтому необходимы альтернативные методы. Механическая инокуляция и методы опрыскивания уже обсуждались в литературе, и здесь мы сравниваем эти методы с недавно предложенной техникой инъекции в черешок. Поскольку наш интерес лежит в области разработки вирусов растений в качестве иммунотерапевтических средств для здоровья человека, а также векторов доставки генов для сельскохозяйственного применения, мы обратились к вирусу табачной мозаики (ВТМ) в качестве модельной системы. Мы изучили эффективность трех методов инокуляции: механической инокуляции, опрыскивания листьев с использованием Silwet-77 и инъекций в черешок. Метод опрыскивания был оптимизирован, и мы использовали 0,03% Silwet L-77 для индукции инфекции с помощью ВТМ или мутантного ВТМ с добавлением лизина (ВТМ-Lys). Мы разработали метод с использованием шприца с иглой для целенаправленной инъекции вируса растений непосредственно в сосудистую систему растения — мы испытали инъекции в стебель и в черешок. Инокуляция в стебель приводила к токсичности, но техника инъекции в черешок была признана жизнеспособной стратегией. ВТМ и ВТМ-Lys были очищены из отдельных растений и из объединенных образцов листьев — в целом между методами наблюдалось мало различий, измеряемых по выходу ВТМ или ВТМ-Lys, что подчеркивает применимость техники шприцевой инъекции для получения вирусных наночастиц. Наблюдалась вариабельность выходов от препарата к препарату: механическая инокуляция, опрыскивание и шприцевая инокуляция давали 40–141 мг, 36–56 мг и 18–56 мг ВТМ на 100 граммов листьев соответственно. Аналогичные выходы были получены с использованием ВТМ-Lys: 24–38 мг, 17–28 мг и 7–36 мг ВТМ-Lys на 100 граммов листьев для механической инокуляции, опрыскивания и шприцевой инокуляции соответственно. Каждый метод имеет свои преимущества: опрыскивание легко масштабируется и поэтому может найти применение в фермерстве; шприцевая инокуляция может обеспечить чистый, асептический и контролируемый подход для молекулярного фермерства фармацевтических препаратов в соответствии с надлежащей производственной практикой (GMP) и даже может быть применима для доставки генов в растения в космосе.

Растения являются одним из двух основных источников пищи (другим источником являются животные), и в связи с растущим спросом на продовольствие, загрязнением окружающей среды, химическими угрозами, а также стихийными бедствиями, такими как засухи и пожары, генная инженерия растений имеет важное значение для производства продуктов питания. Согласно мета-анализу, проведенному в 2021 году, предполагается, что спрос на продовольствие вырастет на 35–46 процентов в период с 2010 по 2050 год (van Dijk и др., 2021). Системы экспрессии на основе растений также являются развивающейся платформой для производства жизненно важных фармацевтических препаратов (Chung и др., 2021). Эта концепция молекулярного фермерства была введена в 1986 году для производства гормона роста человека (hGH) в трансгенном табаке и подсолнечнике (Barta и др., 1986) и была реализована несколько лет спустя для антитела IgG1 в трансгенном табаке (Hiatt и др., 1989). В более недавнее время коктейль антител ZMapp, который использовался для лечения пациентов с лихорадкой Эбола во время эпидемии 2014 года, был произведен в Nicotiana benthamiana компанией Kentucky BioProcessing, Inc. (Zhang и др., 2014), в то время как Medicago Inc. использует те же растения для производства сезонных вакцин против гриппа (Ward и др., 2020). Обе компании также произвели кандидаты на вакцины против COVID-19: в то время как Medicago произвела вирусоподобные частицы (Ward и др., 2021), Kentucky BioProcessing произвела платформенную вакцину путем конъюгации домена RBD с вирусом табачной мозаики (ВТМ; Royal и др., 2021). Молекулярное фермерство вышло из младенческого возраста и продемонстрировало свою значимость для производства биофармацевтических препаратов.

Для увеличения производства продуктов питания и развития молекулярного фермерства необходимы усовершенствованные методы доставки генов в растения. Традиционная стабильная генетическая трансформация в основном осуществляется с использованием растительного каллуса и Agrobacterium tumefaciens-опосредованной или биолистической доставки частиц, при этом изучается относительно новая технология с использованием коротких палиндромных повторов (CRISPR) ассоциированного белка 9 (Cas9) (Zhu и др., 2020). Однако трансгенная инженерия растений является дорогостоящей и требует длительных периодов времени для разработки желаемого организма (то есть временной промежуток от каллуса до развитого растения может занимать месяцы). Другими проблемами являются низкий выход трансформации или возникновение нежелательных вариаций; кроме того, жесткие правила регулирования генетически модифицированных организмов (ГМО) ограничивают сферу их применения (Landry и Mitter, 2019; Gad и др., 2020; Zhang и др., 2020a). Временная экспрессия обеспечивает генную инженерию растений с более низкой стоимостью, более быстрым временем выполнения и позволяет обойти нормативные барьеры благодаря своему ограниченному по времени действию и потомству, свободному от трансгенов (Kaur и др., 2021). Это может быть особенно важным для сельскохозяйственных целей – здесь растения могли бы временно экспрессировать гены по мере необходимости в ответ на текущие обстоятельства (например, патогены или экологические угрозы). Например, если бы вредитель поражал территорию, фермеры могли бы защитить свои культуры с помощью временной экспрессии, направленной на усиление защитного механизма растений. Для достижения этой цели была предложена система CRISPR/Cas9 – CRISPR/Cas9 использовалась на полностью выросшем дереве какао для усиления защитного механизма растения путем удаления гена TcNPR3, который, как сообщается, подавляет защитный ответ растения. Ткань листьев из модифицированного дерева какао действительно была защищена от патогена, как было показано с помощью биотеста на патогены (Fister и др., 2018). Аналогичным образом, усиление защитного механизма растения-хозяина было достигнуто с помощью временной экспрессии PnSCR82 в N. benthamiana – что также эффективно защитило растения от патогенной атаки (Wang и др., 2022).

Существует еще возможность для улучшения и развития методов доставки генов, чтобы проложить путь для широкого применения в сельском хозяйстве и промышленности. Для временной экспрессии часто используются A. tumefaciens-опосредованный перенос генов или вирусные векторы, при этом A. tumefaciens может доставляться с помощью вакуум-ассистированной, распылительной и шприцевой агроинфильтрации (Zhang и др., 2020a; Torti и др., 2021). Вирусные векторы растений также доставляются с помощью A. tumefaciens или механической инокуляции (Marillonnet и др., 2004). Альтернативные методы включают перенос генов с помощью наночастиц, таких как углеродные нанотрубки, углеродные точки или другие наночастицы на основе полимеров или металлов (Liu и др., 2009; Demirer и др., 2019; Kwak и др., 2019; Wang и др., 2020); однако неясно, находятся ли эти синтетические материалы на одном уровне с биологическими системами с точки зрения эффективности и результативности.

Использование этих методов варьируется в зависимости от применения. Для листового введения: вакуумная или шприцевая инфильтрация используются для A. tumefaciens. Для вирусных векторов и наночастиц: может использоваться механическая, распылительная или шприцевая инокуляция. При вакуум-инфильтрации растения погружают в ванну, содержащую агробактерии и гормоны для стимуляции переноса генов, затем в камере инфильтрации создается вакуум; этот метод требует вакуумной установки и растения, с которым можно легко обращаться для помещения в эту установку. Агробактерии переносят генную кассету для временной экспрессии целевого гена (Gleba и др., 2013). Для шприцевых методов используется безыгольный шприц для непосредственной инфильтрации листьев суспензией агробактерий, содержащей гормоны для активации переноса генов (Gleba и др., 2013). При механической инокуляции вирусные векторы обычно осторожно втирают в листья, посыпанные карборундом, для индукции поражений и обеспечения симпластической доставки (Hull, 2009). Для распылительных методов листовой обработки используются поверхностно-активные вещества, такие как Silwet-77, для снижения поверхностного натяжения и обеспечения транспорта активных ингредиентов через восковую кутикулу в листья через поры и устьица с последующим симпластическим или апопластическим поглощением (Hu и др., 2020a). Поверхностно-активные вещества также использовались для цветочной дип-обработки (O'Callaghan, 2016).

В этой работе мы сравниваем механический метод, распыление с Silwet-77 и недавно предложенный метод сосудистой шприцевой инокуляции – мы использовали ВТМ в качестве модельной системы. ВТМ был выбран потому, что он используется в качестве вирусного вектора (Kagale и др., 2012), а также в качестве наночастичной платформы для разработки вакцин и доставки лекарств (Chung и др., 2020). Мы рассматривали ВТМ только как модельную систему в этой работе, поскольку наш основной интерес заключается в производстве и разработке вирусных наночастичных систем для вакцин и иммунотерапевтических применений (Cai и др., 2019; Shin и др., 2020; Ortega-Rivera и др., 2021). Кроме того, хотя трансформация на основе агробактерий является золотым стандартом для временной экспрессии фармацевтических белков, мы не рассматривали ее здесь по следующим причинам: грамотрицательные бактерии вносят липополисахариды (ЛПС) в иначе свободную от ЛПС растительную производственную систему. ЛПС должны быть удалены с помощью дополнительных этапов очистки для соответствия требованиям безопасности FDA. Для вирусных наночастиц растений удаление ЛПС может быть сложной задачей; высказано предположение, что ЛПС связываются с внутренними и внешними поверхностями вириона. В предыдущей работе мы разработали стратегии удаления ЛПС, однако использовались многоступенчатые методы, что значительно снижало выходы (Wang и др., 2019). Другим ограничением для системы на основе агробактерий является то, что необходимо производить как бактерии, так и растения, что делает систему более громоздкой.

Используя ВТМ в качестве модельной системы, мы сравнили механический метод, листовое распыление с Silwet-77 и инъекцию с иглой в стебель или черешок. В то время как распылительная инокуляция является масштабируемым методом и может быть полезна для полевого применения в сельском хозяйстве, шприцевая инокуляция может обеспечить чистый асептический контролируемый подход для молекулярного фермерства фармацевтических препаратов в соответствии с надлежащей производственной практикой (GMP). Этот метод также может представлять интерес, если или когда молекулярное фермерство будет внедрено в космическом пространстве (McNulty и др., 2021). Мы использовали Nicotiana benthamiana в качестве модельного растения, поскольку оно широко используется как «биореактор» в молекулярном фермерстве. Три метода инокуляции были выполнены параллельно, и были определены выходы производства ВТМ. Схема экспериментального дизайна показана на Рисунке 1.

Рисунок 1 Схематическое представление экспериментального дизайна. ВТМ использовался в качестве модели для тестирования механического, распылительного и шприцевого методов инокуляции (A). Фотографии, демонстрирующие применение ВТМ с помощью механического, распылительного и шприцевого методов инокуляции (B). Растения с BioRender.com.

Выращивание Nicotiana benthamiana и инокуляция ВТМ

Семена N. benthamiana высевали в почву Pro Mix BX (Greenhouse Megastore) и выращивали в камере A1000 (Conviron) при освещении ~100 000 люкс, влажности 50–60% и температуре 25°C. Через 2 недели сеянцы пересаживали в большие горшки, удобрение вносили один раз в неделю (удобрение Jack's Fertilizer #77840, JR Peters Inc.). Когда растения достигали возраста 4–5 недель, проводили инокуляцию, как подробно описано ниже. После визуального осмотра и подтверждения симптомов листья собирали через 10–15 дней после инокуляции и хранили при –80°C до дальнейшей обработки. Инокуляции проводили с помощью механической инокуляции листьев, посыпанных карборундом, распыления с Silwet-77 (0,02–0,04%) и прямой инъекции в стебель и черешок. Использовали 3, 15 и 30 мкг очищенного ВТМ в 10 мМ фосфатном буфере натрия (NaPB) pH 7,4, по 10 растений на обработку. Фотодокументацию проводили на 0, 8, 10 и 15 день после инокуляции ВТМ. В наших исследованиях мы использовали нативный ВТМ, а также мутант ВТМ с добавлением лизина, обозначенный как ВТМ-Lys, описанный в Geiger и др., 2013.

Механическая инокуляция ВТМ

Карборунд (C192-500, Thermo Fisher Scientific) осторожно наносили на три листа, а затем втирали вручную со 100 мкл ВТМ (0,01 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,1 мг/мл) и NaPB буфером pH 7,4 для доставки 3 мкг, 15 мкг или 30 мкг ВТМ. Перчатки меняли между каждым растением во избежание переноса инфекционного материала. Растения оставляли в темноте на 1 час после обработки (во избежание ожогов от карборунда под лампами выращивания), затем промывали водопроводной водой и помещали в камеру для выращивания растений.

Распылительная инокуляция ВТМ

Для заражения растений использовали триггерную распылительную насадку (3 345, Control Company), как показано на Рисунке 1B. Было выполнено три распыления, каждое объемом ~880 мкл различных концентраций ВТМ в NaPB буфере pH 7,4 с Silwet L-77 в различных концентрациях – 0,04, 0,03 и 0,02% по объему. ВТМ в концентрациях 0,0034 мг/мл, 0,017 мг/мл и 0,0341 мг/мл использовали для доставки 3 мкг, 15 мкг или 30 мкг ВТМ. После инокуляции растения немедленно помещали в камеру выращивания – промывка не требовалась.

Шприцевая инокуляция ВТМ

Использовали инсулиновые шприцы с иглой 8 мм × 31 G (328 438, BD Medical Device Company), загруженные 2 мкл ВТМ в концентрации 1,5, 7,5 или 15 мг/мл в NaPB буфере pH 7,4 для доставки 3 мкг, 15 мкг или 30 мкг ВТМ. Место инъекции тестировали на стебле и черешке. После инъекции растения немедленно помещали в камеру выращивания – промывка не требовалась.

Экстракция и очистка ВТМ

Экстракцию и очистку ВТМ и ВТМ-Lys проводили, как описано Bruckman и Steinmetz (2014). Вкратце, листья гомогенизировали в NaPB буфере с помощью коммерческого блендера (6812-001, Oster), затем эту смесь фильтровали через марлю (NC9442780, Fisher Scientific) и центрифугировали (центрифуга Beckman Coulter Avanti® J-E, 11 000 g в течение 20 мин при 4°C). Супернатант затем фильтровали через Kimwipes (21905–011, VWR) и смешивали с равными частями хлороформ/бутанол (AC423550040/A399-4, Fisher Scientific) и перемешивали в течение 30 мин при 4°C. Затем эту смесь центрифугировали (центрифуга Beckman Coulter Avanti® J-E, 4 500 g в течение 10 мин при 4°C), и верхний водный слой, содержащий вирус растений, отбирали для следующих этапов. Вирусные частицы затем осаждали с использованием 8% (мас./об.) ПЭГ (MW 8000 Да) и 0,2 М NaCl (BP233-1 и BP358-212, Fisher Scientific); эту смесь затем оставляли на шейкере на ночь при 4°C. Раствор затем центрифугировали (центрифуга Beckman Coulter Avanti® J-E, 22 000 g в течение 20 мин при 4°C), и осадок ресуспендировали в 0,1 М NaPB буфере pH 7,4. После еще одного короткого центрифугирования (центрифуга Beckman Coulter Avanti® J-E, 9 000 g в течение 15 мин при 4°C) супернатант подвергали ультрацентрифугированию (центрифуга Beckman Coulter Optima™ L-90 K, 160 000 g в течение 3 ч при 4°C) через 40% сахарозную подушку (S0389, Sigma-Aldrich). Осадок затем оставляли на шейкере на ночь для ресуспендирования в 10 мМ NaPB буфере pH 7,4. На финальном этапе раствор пропускали через кремнеземную колонку (17-0851-01, Cytiva).

Характеризация ВТМ

Для подтверждения чистоты и структурной целостности очищенного ВТМ проводили УФ-видимую спектроскопию, SDS-PAGE и трансмиссионную электронную микроскопию (ТЭМ).

УФ-видимая спектроскопия

Концентрацию ВТМ определяли с помощью УФ-видимой спектроскопии на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) и закона Бера-Ламберта с коэффициентом экстинкции ВТМ при 260 нм, равным 3 мл мг⁻¹ см⁻¹.

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия

Для подготовки образца 2 мкг ВТМ из исходного очищенного раствора разбавляли до конечного объема 15 мкл NaPB буфером pH 7,4, к которому добавляли 4 мкл 4-кратного буфера для загрузки с додецилсульфатом лития (LDS) (Life Technologies). Этот раствор затем денатурировали в течение 5 мин при 95°C и анализировали на гелях NOVEX NuPAGE 4–12% Bis-Tris (Invitrogen) в 1-кратном буфере MOPS (ThermoFisher Scientific). В качестве молекулярного стандарта использовали SeeBlue Plus2. Гель работал при 200 В/120 мА в течение 40 мин. Гели окрашивали Кумасси бриллиантовым синим R-250 и визуализировали с помощью системы AlphaImager (Protein Simple).

Трансмиссионная электронная микроскопия

ВТМ в концентрации 0,01, 0,05 или 0,1 мг/мл наносили на медные сетки для ТЭМ, покрытые пленкой Formvar с углеродным покрытием (VWR International), и окрашивали 2% (мас./об.) ацетатом уранила (Agar Scientific). Изображения затем получали с помощью ТЭМ FEI TecnaiSpirit G2 BioTWIN при 300 кВ.

Протоколы механической, распылительной и шприцевой инокуляции были оптимизированы

Для механической инокуляции следовали установленным протоколам. Для листового распыления оптимизировали концентрацию Silwet L-77. Silwet L-77 использовался для вакуум-ассистированной агроинфильтрации в концентрации 0,1 и 0,03% (Vojta и др., 2015); для агрораспылительных применений Silwet L-77 использовался в концентрации 0,1% (Hahn и др., 2015). Данные также показывают, что 0,1% Silwet L-77 было достаточно для доставки наночастиц растениям томата (Zhang и др., 2020b), в то время как 0,2 и 0,3% требовались для доставки наночастиц хлопку и кукурузе (Hu и др., 2020). Основываясь на этих данных, распыление 0,02–4% Silwet L-77 применяли к 4–5-недельным и 6–7-недельным растениям N. benthamiana. При использовании 4–5-недельных растений и имитационных инокуляций мы отметили, что через 24 часа после воздействия поверхностно-активного вещества концентрации выше 0,04% вызывали повреждение тканей, что было заметно по обесцвечиванию или потемнению листьев; более высокие концентрации поверхностно-активного вещества (>0,4%) приводили к некрозу тканей. Мы отметили, что возраст растений играет роль: более старые растения (6–7 недель) были более устойчивыми, и меньше некроза наблюдалось при более высоких концентрациях поверхностно-активного вещества (0,4% Silwet L-77, Дополнительный Рисунок S1). Для заражения ВТМ мы тестировали инокуляцию с использованием 0,02 и 0,03% Silwet-L-77, однако только листовое распыление ВТМ в присутствии 0,03% Silwet-L-77 давало видимые симптомы (данные не показаны), поэтому эта концентрация поверхностно-активного вещества использовалась во всех остальных экспериментах.

Для сосудистого шприцевого метода мы оценивали возможность введения вирусного вектора в стебель и черешок. В качестве первого теста мы доставили флуорофор Oregon Green 488™ для отслеживания инъецированного раствора в растении с помощью визуализации под УФ-светом (Рисунки 2A,B, 3A,B). Введение ВТМ в черешок приводило к системной инфекции (см. Рисунки 4, 5). В то время как введение красителя или ВТМ в черешок не вызывало побочных эффектов (Рисунки 2C,D), инъекция в стебель приводила к появлению некротической ткани, наблюдаемой примерно через 8 дней после инокуляции (dpi), и приводила к системному некрозу и гибели растений (Рисунки C–E). Основываясь на этом, черешок был выбран в качестве оптимизированного места инъекции.

Рисунок 2 Фотодокументация инъекции флуорофора Oregon Green 488™ в черешок; растения визуализировали под УФ-светом (A,B). Фотография инъекции ВТМ в черешок (C,D).

Рисунок 3 Фотографии после инъекции флуорофора Oregon Green 488™ в стебель растения; растение визуализировали под УФ-светом (A,B). Фотодокументация инъекции ВТМ в стебель (C). После инокуляции ранние признаки некротической ткани наблюдались в стебле, в среднем через 8 дней после заражения (D), что приводило к расширению некроза, вызывая некроз листьев и гибель (E). Следовательно, шприцевая инокуляция вируса в стебель не является подходящим методом для инфекционного вектора – она может подходить для неинфекционных наночастиц.

Рисунок 4 Репрезентативные фотографии N. benthamiana с 0 по 10–15 день, контрольные незараженные растения (A) и ВТМ в дни после инокуляции (dpi) механическим (B), распылительным (C) и шприцевым (D) методом с использованием 3, 15 и 30 мкг ВТМ. График выходов и таблица значений выходов ВТМ (E). Эксперименты были выполнены в дубликатах с использованием 10 растений на обработку. Дополнительные контрольные растения показаны в Дополнительной информации, Дополнительный Рисунок S3.

Рисунок 5 Репрезентативные симптомы N. benthamiana, зараженной ВТМ-Lys. Фенотип 1 показывает генерализованную желтую крапчатость листьев, усиливающуюся со временем. Фенотип 2 показывает почернение жилок с одновременным пожелтением листьев.

Различные фенотипы заражения ВТМ после механического, распылительного и шприцевого методов инокуляции

Для демонстрации надежности методов мы сначала инокулировали растения ВТМ, а затем повторили эксперименты с использованием мутанта ВТМ с добавлением лизина, ВТМ-Lys. Фотодокументация растений, зараженных ВТМ, показана на Рисунке 4, а растения с ВТМ-Lys показаны на Дополнительном Рисунке S2 и Рисунке 5. Основной фенотип при заражении ВТМ включает мозаичный/крапчатый рисунок, некроз, неравномерную окраску, пожелтение и скручивание листьев; однако также сообщалось о других симптомах, таких как почернение жилок (Scholthof, 2004). В наших исследованиях мы наблюдали различные симптомы в зависимости от метода инокуляции.

При механической инокуляции местные симптомы появлялись через 8 дней после инокуляции (dpi), а системные инфекции устанавливались через 10+ dpi. Репрезентативные фотографии показаны на Рисунке 4B. Наиболее распространенными симптомами, наблюдаемыми при механической инокуляции, были мозаичные/крапчатые узоры, пожелтение листьев и наличие некротической ткани. Тяжесть симптомов была выше, когда растения инокулировали 30 мкг ВТМ по сравнению с 3 мкг.

В отличие от механической инокуляции, растения, инокулированные распылением, показывали симптомы на 10 день (на 2 дня позже), а при 15+ dpi сообщалось о системной инфекции. В целом, несколько замедленный временной график установления экспрессии генов и, следовательно, инфекции для распыления по сравнению с механической инокуляцией согласуется с другими сообщениями: в то время как традиционная вакуумная инфильтрация занимает в среднем 4–7 дней для экспрессии генов, экспрессия генов задерживается при доставке через агрораспыление, и экспрессия генов была подтверждена через 10–14 dpi (Hahn и др., 2015). Преобладающими симптомами при распылительной инокуляции были пожелтение и скручивание листьев (Рисунок 4C). При использовании более высоких концентраций ВТМ (15 и 30 мкг) мы также отмечали у некоторых растений почернение жилок и некротическую ткань (не показано).

Шприцевая инокуляция показывала симптомы ВТМ на 10 день и системную инфекцию на 15 день. Наблюдались различные симптомы ВТМ с двумя основными фенотипами: мозаичные/крапчатые симптомы и почернение жилок (Рисунок 4D) – последние симптомы также наблюдались для ВТМ-Lys, когда растения инокулировали шприцевой инъекцией в стебель (Рисунок 5). Для обработок, инокулированных 15 и 30 мкг ВТМ, симптомы у растений были четкими, однако при 3 мкг ВТМ симптомы оставались почти незаметными. Наиболее существенным различием между различными методами инокуляции была степень вариабельности в отношении того, устанавливалась ли системная инфекция. В то время как у большинства растений системная инфекция устанавливалась к 15 dpi, у некоторых растений заражение ВТМ не устанавливалось. Данные сообщают, что ВТМ требует загрузки в флоэму для установления системной инфекции (Cheng и др., 2000) – поэтому вероятно, что у растений, у которых отсутствовало заражение ВТМ, инъекция не попадала во флоэму. Таким образом, есть возможность для дальнейшего совершенствования этого метода инъекции с использованием прецизионных игл для прямого попадания во флоэму.

Было рассмотрено несколько контролей: контрольные растения выращивались рядом в том же помещении, но в отдельном инкубаторе; эти растения не показывали симптомов заражения ВТМ и показаны на Рисунке 4A. Кроме того, для каждой обработки выполнялся контроль следующим образом: для механической инокуляции растения втирали карборундом без ВТМ, для распылительной инокуляции наносили 0,03% Silwet L-77 в NaPB буфере pH 7,4, а для шприцевой инокуляции инъецировали NaPB буфер pH 7,4. Заражения или симптомы не проявлялись, и эти данные показаны в Дополнительном Рисунке S3.

Выходы для механического, распылительного и шприцевого методов статистически не различаются

Для сбора ВТМ собирали все видимо зараженные листья. Хотя наблюдалась некоторая вариабельность выходов при сравнении трех методов инокуляции, статистических различий между методами не было (Рисунок 4E – ВТМ; Рисунок 6 – ВТМ-Lys). Сначала обсудим данные по ВТМ: здесь листья объединяли, и очищали 100 граммов листового материала; данные показывают сопоставимые выходы с тенденцией к увеличению выхода при механической инокуляции в более высокой дозе: механическая инокуляция с использованием 3 мкг против 30 мкг ВТМ давала 46 против 90 мг ВТМ на 100 г зараженной листовой ткани – аналогичная тенденция также наблюдалась для шприцевого метода (16 против 37 мг). Напротив, для распылительной инокуляции с ВТМ не было дозовой зависимости, выходы составляли 43–46 мг ВТМ на 100 г зараженной листовой ткани (однако эти эксперименты были выполнены с небольшим размером выборки). Эти тенденции также согласуются с наблюдаемыми симптомами: в целом, механическая инокуляция приводила к более тяжелым симптомам по сравнению с распылительной инокуляцией. Растения, инокулированные шприцевым методом, имели высокую вариабельность симптомов ВТМ: некоторые растения показывали тяжелую инфекцию, в то время как другие имели только легкие симптомы. Хотя мы не ставили целью изучение количества листьев, зараженных на растение, как параметра в наших исследованиях, заметных различий не наблюдалось.

Рисунок 6 График и таблица, показывающие выходы ВТМ-Lys при различных методах инокуляции (механический, распылительный, шприцевой) с использованием 3 или 30 мкг вируса растений. Для групп Y1, Y2 и Y3 данные были получены путем экстракции ВТМ-Lys из одного растения (открытые символы) – выходы были нормализованы на 100 граммов листьев для сравнения с объединенными образцами (Y4, заполненные символы). Группа Y4 – это выходы из объединенных листьев от 10 растений. Данные хорошо согласуются независимо от размера выборки.

Аналогичная тенденция наблюдалась при использовании ВТМ-Lys: здесь мы сравнили выходы ВТМ-Lys на 100 граммов зараженных листьев с использованием объединенных образцов, как это делалось для ВТМ, но мы также выполнили экстракции из отдельных растений, а затем нормализовали выходы на 100 г листовой ткани. Данные, сравнивающие экстракции из отдельных растений и объединенных листьев, хорошо согласуются (Рисунок 6). Выходы ВТМ-Lys были сопоставимы при любой дозе, составляя 24–28 мг ВТМ-Lys на 100 г зараженной листовой ткани. Также шприцевая инокуляция давала немного более низкие, но стабильные выходы – 17–19 мг ВТМ-Lys на 100 г зараженной листовой ткани. Только механическая инокуляция показывала тенденцию к дозовой зависимости, удваивая выходы при более высокой дозе (34 против 18 мг ВТМ-Lys на 100 г зараженной листовой ткани для механической инокуляции с использованием 30 мкг против 3 мкг ВТМ-Lys, Рисунок 6).

Данные свидетельствуют о том, что дозовой зависимости нет, когда вирусные векторы инокулируются с помощью листового распыления. Возможное объяснение заключается в механизме действия поверхностно-активного вещества. Применение Silwet L-77 открывает проникновение через устьица и кутикулярный путь, при этом устьица являются основным входом (Hu и др., 2020). Следовательно, заражение ВТМ в N. benthamiana зависит от структуры листьев, то есть количества устьиц, а также от способности поверхностно-активного вещества открывать пути проникновения. Поэтому можно предположить, что независимо от количества ВТМ, доступного на поверхности листа, только определенное количество попадет во внутриклеточную среду растения. Это согласуется с низкими показателями трансфекции, сообщаемыми для доставки плазмид с помощью агрораспыления, где уровень экспрессии составлял 0,9–3,5% – в резком контрасте с этим сообщается о высоких показателях экспрессии для вирусных векторов, достигающих эффективности до 93%; последнее можно объяснить клеточно-клеточным и системным движением вирусного вектора (Hahn и др., 2015). Также выходы при шприцевой инокуляции не показали дозовой зависимости, но успешность заражения была более вариабельной (см. выше).

Идентичность ВТМ является неизменной для механического, распылительного и шприцевого методов

После экстракции ВТМ из растений проводили УФ-видимую спектроскопию, SDS-PAGE и трансмиссионную электронную микроскопию (ТЭМ) для подтверждения идентичности ВТМ. Данные УФ-видимой спектроскопии показывают соотношение поглощения 260/280, равное 1,2, что соответствует цельным и чистым препаратам ВТМ¹, а значения варьировались в пределах 1,18 ± 0,03. Изображения ТЭМ показывают цельный ВТМ с типичной морфологией и высоким аспектным соотношением (Рисунок 7A). SDS-PAGE анализ согласуется с наличием чистых препаратов ВТМ, показывая белок оболочки ВТМ 17,5 кДа; растительные загрязнения не обнаруживались; также загрязнение контрольных растений не было обнаружено (Рисунок 7B; Дополнительный Рисунок S4).

Рисунок 7 Изображения ТЭМ ВТМ и ВТМ-Lys, полученных различными методами инокуляции, масштабная линейка представляет 200 нм (A). SDS-PAGE экстрагированных ВТМ и ВТМ-Lys, наличие его белка оболочки (17,5 кДа) было неизменным во всех образцах (B).

В этом исследовании мы сравнили механический метод, листовое распыление и инъекцию в черешок и стебель ВТМ (и ВТМ-Lys) в качестве модельной системы для доставки генов. Успешная доставка генов измерялась установлением инфекции. В то время как инъекция в стебель растения приводила к системной токсичности и гибели растений, инъекция в черешок оказалась продуктивной с хорошей скоростью заражения и выходами, сопоставимыми с любым другим методом. Каждый из этих методов имеет свои преимущества: механическая инокуляция показывает высокую степень воспроизводимости благодаря простоте метода. Листовое распыление является масштабируемым и может предложить широкую платформу для сельскохозяйственной инженерии и может обеспечить временную доставку генов на больших площадях посевов. Шприцевая инокуляция обеспечивает асептический метод, который может подходить для фармацевтической промышленности. По сравнению с текущим стандартом методов трансформации на основе агробактерий, шприцевая инокуляция не требует культивирования грамотрицательных бактерий, которые (i) могут подвергаться эпигенетической вариабельности, (ii) вносят ЛПС в продукт, что затем требует дополнительных этапов очистки, и (iii) добавляют сложность в производственную установку, требуя как растений, так и ферментера. Хотя трансформация на основе агробактерий является эффективной и текущим отраслевым стандартом, альтернативные подходы, такие как шприцевая инокуляция, являются интересной технологией для изучения. Существует возможность для инноваций: скорость заражения или скорость доставки генов может быть улучшена с помощью использования прецизионных шприцев для попадания во флоэму или ксилему для желаемого применения. Фактически, применение микроигл для инженерии растений было предложено (Cao и др., 2020).

Дополнительные материалы к этой статье можно найти онлайн по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.963756/full#supplementary-material

¹ www.dpvweb.net

Monroy-Borrego AG and Steinmetz NF (2022) Three methods for inoculation of viral vectors into plants. Front. Plant Sci. 13:963756. doi: 10.3389/fpls.2022.963756

Перевод статьи «Three methods for inoculation of viral vectors into plants» автора Monroy-Borrego AG and Steinmetz NF, оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык