Обнаружение и геномная характеристика продуцирующей ESBL Escherichia coli, содержащей ген mcr-1, в почвах сельскохозяйственных угодий

Появление и распространение гена мобильной устойчивости к колистину (mcr-1) стало серьезной проблемой для глобального общественного здравоохранения. На сегодняшний день этот ген широко обнаружен у сельскохозяйственных животных, домашних питомцев, в продуктах питания и у людей. Однако информация о загрязнении почв сельскохозяйственных угодий бактериями, содержащими mcr-1, крайне скудна.

В августе 2016 года в провинции Шаньдун (Китай) было проведено исследование продуцирующих ESBL изолятов Escherichia coli, выделенных из почв сельскохозяйственных угодий. Мы наблюдали устойчивость к колистину у 12 из 53 (22,6%) изолятов энтеробактерий, продуцирующих ESBL, из почв угодий. Было обнаружено шесть штаммов E. coli, положительных по mcr-1, происходящих из района с интенсивным животноводством. Эти изоляты принадлежали к четырем различным ST (типам последовательностей) — ST2060, ST3014, ST6756 и ST1560 — и несли множество дополнительных генов устойчивости. E. coli с геном blaNDM-1 также была обнаружена в образце почвы из того же района. Сравнительное секвенирование полных геномов и анализ S1-PFGE показали, что у четырех изолятов ген mcr-1 был встроен в хромосому, а у двух изолятов находился на плазмидах IncHI2. Насколько нам известно, мы сообщаем о первом выделении mcr-1 у продуцирующих ESBL E. coli из почв сельскохозяйственных угодий. Эта работа подчеркивает важность активного эпиднадзора за устойчивыми к колистину микроорганизмами в почве. Кроме того, необходимы исследования, посвященные влиянию внесения навоза животных на передачу бактерий, продуцирующих mcr-1.

Детерминанты противомикробной резистентности, распространению которых способствует деятельность человека, все чаще признаются emerging (возникающими) загрязнителями окружающей среды, способными представлять угрозу для здоровья человека (Sanderson и др., 2016). Хорошо известно, что большие количества антибиотиков попадают от человека и животных на сельскохозяйственные поля при внесении навоза в качестве удобрения (Jechalke и др., 2014). Впоследствии эти вещества могут влиять на структуру и функцию бактериальных сообществ in situ и дополнительно приводить к увеличению распространенности и трансферабельности генов устойчивости к антибиотикам (ARG) (Jechalke и др., 2014). Продуцирующие β-лактамазы расширенного спектра (ESBL) энтеробактерии являются важной группой бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (MDR), что представляет собой серьезную проблему для общественного здравоохранения (Bush и Fisher, 2011). Антимикробная терапия с использованием колистина как отдельно, так и в комбинации с другими антибиотиками, рассматривается как вариант лечения «последней линии» против бактериальных инфекций, вызываемых MDR-грамотрицательными патогенами (Paterson и Harris, 2016). В глобальном масштабе поступает все больше сообщений об устойчивых к колистину энтеробактериях. Особенно бактерии, продуцирующие ESBL или карбапенемазы, ассоциированы с устойчивостью к колистину; эти устойчивые к колистину бактерии представляют серьезную угрозу для здоровья из-за ограниченности доступных терапевтических вариантов (van Duin и Doi, 2015).

В последнее время озабоченность вызывает растущая распространенность устойчивых к колистину энтеробактерий в связи с обнаружением первого гена устойчивости к колистину, передающегося плазмидным путем — mcr-1, который был идентифицирован в Китае (Liu и др., 2016). С момента первого сообщения о mcr-1 гены mcr, включая mcr-1/2/3/4/5, были обнаружены у животных, в продуктах питания, в микробиоте человека и клинических образцах в более чем 30 странах (Gao и др., 2016; Xavier и др., 2016; Borowiak и др., 2017; Carattoli и др., 2017; Yin и др., 2017). Примечательно, что наша и другие исследовательские группы уже обнаружили изоляты энтеробактерий, содержащие MCR-1 и карбапенемазы, что вызывает серьезные опасения по поводу возможного глобального распространения панрезистентных патогенов (Zheng и др., 2016).

На сегодняшний день ген mcr обнаружен по всему миру в образцах от человека и животных; однако его наличие в образцах окружающей среды описывалось редко. В нескольких предыдущих исследованиях документировано появление продуцирующих ESBL энтеробактерий, несущих mcr, в речных и сточных водах (Zurfuh и др., 2016; Ovejero и др., 2017; Sun P. и др., 2017), что свидетельствует о распространении гена mcr из ветеринарной среды в водные экосистемы. Устойчивость к колистину представляет угрозу для здоровья человека и животных во всем мире, а почвенные экосистемы являются одним из основных секторов загрязнения окружающей среды антибиотикорезистентными бактериями. Однако масштабы и значение появления продуцирующих MCR изолятов в почве до сих пор не выяснены.

Цель данного исследования состояла в том, чтобы описать встречаемость изолятов Escherichia coli, несущих одновременно гены blaCTX-M и mcr, которые были исходно выделены из почв сельскохозяйственных угодий Китая. Мы также стремились раскрыть геномную структуру mcr-положительных изолятов E. coli и расшифровать механизмы устойчивости к колистину среди этих экологических изолятов.

Место проведения исследования и отбор почвенных образцов

В августе 2016 года мы собрали образцы почв сельскохозяйственных угодий из 32 различных сельских точек в провинции Шаньдун, Китай (дополнительный рисунок S1). Семьи на участках исследования чаще всего проживали в четырехкомнатных домах с уличным туалетом, расположенным во дворе. Большинство семей содержали кур и свиней во дворе. Отходы туалетов утилизировались силами самих семей, а навоз от животных часто вносился на сельскохозяйственные поля. Из каждой точки было получено по три неповторяющихся образца, географическое положение которых определялось с точностью менее 0,5 м. Все образцы отбирались из более глубоких слоев (глубина 3–10 см) в пределах участка 20 см × 20 см и хранились на льду во время транспортировки.

Выделение продуцентов ESBL

Каждый образец (2,0 г) гомогенизировали с пятикратным объемом стерильной жидкой среды Луриа–Бертани (LB) (около 10 мл) и культивировали при 37°C в течение ночи. Обогащенные растворы высевали на агар МакКонки с добавлением 2 мг/л цефотаксима на 18–24 ч при 37°C для выделения потенциальных штаммов, продуцирующих ESBL. Продукцию ESBL подтверждали с помощью теста двойных дисков (DDST) в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) (CLSI, 2017). Изоляты, продуцирующие ESBL, идентифицировали методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации — времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS).

Определение чувствительности к противомикробным препаратам и обнаружение генов резистентности

Микробульонный метод разведений использовали для определения чувствительности к противомикробным препаратам у продуцентов ESBL, а результаты интерпретировали с использованием пороговых значений CLSI. Для колистина и тигециклина использовали пороговые значения EUCAST¹. Изоляты, продуцирующие ESBL, дополнительно подвергали ПЦР для обнаружения генов mcr (mcr-1, mcr-2, mcr-3 и mcr-4), генов карбапенемаз и генов ESBL, как описано ранее (Branas и др., 2015; Liu и др., 2016; Xavier и др., 2016; Carattoli и др., 2017; Yin и др., 2017).

Мультилокусное секвенирование типов и пульс-электрофорез в геле

Мультилокусное секвенирование типов (MLST) проводили в соответствии с протоколами, описанными в базе данных E. coli (Wirth и др., 2006) и базе данных Klebsiella pneumoniae (Brisse и др., 2009). Клональность изолятов, положительных по mcr-1, оценивали с помощью электрофореза в пульсирующем поле (PFGE) с ферментом XbaI, и для анализа генетического родства использовали пороговые линии на уровне 85% (Zheng и др., 2015). S1-PFGE, гибридизацию и эксперименты по конъюгации проводили, как описано ранее (Zheng и др., 2016).

Полногеномное секвенирование (WGS) и in silico анализ

Для характеристики генетических особенностей изолятов, несущих mcr, было проведено полногеномное секвенирование (WGS) шести изолятов с использованием платформы Illumina HiSeq (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США). Контроль качества данных WGS проводили, как описано ранее (Zhang и др., 2014). Данные секвенирования были собраны с использованием SOAPdenovo (Luo и др., 2012), а затем запросы были сгенерированы с использованием базы данных ResFinder 2.1 (Zankari и др., 2012) для идентификации приобретенных ARG. PlasmidFinder 1.3 использовали для идентификации типов репликонов плазмид (Carattoli и др., 2014). Также проводили профилирование плазмид с использованием plasmidSPAdes для сборки плазмид из данных WGS (Antipov и др., 2016).

Эксперименты по конъюгации и анализ плазмид

Трансферабельность плазмид, несущих mcr, из изолятов определяли с помощью фильтровой конъюгации с использованием E. coli J53 в качестве штамма-реципиента, смешанного в соотношении 1:1 в бульонной культуре, как описано ранее (Zheng и др., 2015). Полученные трансконъюганты отбирали на агаровых пластинах BHI с добавлением колистина (2 мг/л). Колонии идентифицировали как E. coli J53 с помощью MALDI-TOF MS, и такие колонии были подвергнуты скринингу и секвенированию на наличие гена mcr-1. Размеры плазмид определяли с помощью метода S1-нуклеазы PFGE (S1-PFGE) (Zheng и др., 2015). Кроме того, для определения генетической локализации с использованием специфических зондов к гену mcr проводили Саузерн-блоттинг-анализ. Идентификацию типов репликонов групп несовместимости (Inc) плазмид проводили с помощью мультиплексной ПЦР, как описано ранее (Carattoli и др., 2005).

Номера доступа

Полные геномные последовательности штаммов E. coli, положительных по mcr-1, депонированы в GenBank под следующими номерами доступа: номер доступа MVOR00000000 (E4), MVOS00000000 (E11), MVOT00000000 (E24), MVOU00000000 (E38), MVOV00000000 (E43) и MVOW00000000 (E47).

Идентификация продуцирующих ESBL энтеробактерий

Анализ 96 почвенных образцов привел к выделению 53 продуцирующих ESBL энтеробактерий, включая 42 изолята E. coli и 11 изолятов K. pneumoniae. Результаты МИК показали, что 50 (96,2%) изолятов проявляли множественную лекарственную устойчивость, которая определялась как устойчивость по крайней мере к трем различным классам противомикробных препаратов (дополнительная таблица S1). Наивысший уровень чувствительности наблюдался к имипенему (100%), за которым следовали меропенем (96,2%), тигециклин (94,3%), колистин (79,2%) и полимиксин B (75,5%). Гены blaCTX-M были обнаружены у 50 (96,2%) изолятов. Наиболее распространенным геном blaCTX-M был blaCTX-M-14 (n = 21), за которым следовали blaCTX-M-27 (n = 13), blaCTX-M-65 (n = 10), blaCTX-M-55 (n = 9), blaCTX-M-11 (n = 2), а также blaCTX-M-3, blaCTX-M-15 и blaCTX-M-17 (по n = 1 для каждого) (дополнительная таблица S2). Для E. coli в клиническом контексте ST10, ST38, ST131 и ST405 ответственны за распространение CTX-M по всему миру (Hernandez и Gonzalez-Acuna, 2016). ST среди продуцирующих ESBL E. coli, наблюдаемых в данном исследовании, были совершенно иными, и только ST10 (n = 2) был обнаружен среди вышеупомянутых ST. Примечательно, что хотя продуцирующие NDM-1 штаммы редко выделяются из почвы (Wang и Sun, 2015), ген blaNDM-1 был идентифицирован в штамме E28 (дополнительная таблица S1). Кроме того, 10 (23,8%) E. coli и 2 (18,2%) K. pneumoniae были устойчивы к колистину и полимиксину B. В настоящее время известные механизмы устойчивости к колистину включают модификации липополисахарида и могут кодироваться как хромосомно, так и плазмидными генами mcr-1/2/3/4 (Poirel и др., 2017). В нашем исследовании шесть изолятов были положительными по mcr-1, и ни один из изолятов не нес детерминант mcr-2/3/4. Секвенирование ДНК полноразмерного гена mcr показало 100% совпадение нуклеотидной идентичности с последовательностью mcr-1, описанной в оригинальной публикации. Интересно, что продуцирующие mcr-1 изоляты были выделены из пяти точек отбора проб, все из которых были расположены в районе с интенсивным животноводством (дополнительный рисунок S1). Кроме того, за исключением изолятов E31 и E7, изоляты E91, E95, K63 и K64 были высокоустойчивы к колистину (>16 мг/л). Механизм резистентности, ответственный за высокие значения МИК, может быть обусловлен мутациями в двухкомпонентной системе pmrAB, которые могут приводить к увеличению степени модификаций ЛПС, что, в свою очередь, снижает сродство к колистину (Poirel и др., 2017).

Встречаемость E. coli, содержащей MCR-1, в почвах сельскохозяйственных угодий

Шесть продуцентов mcr-1 принадлежали к ST2060 (n = 3), ST3014, ST6756 и ST1560 (рисунок 1). Ранее не сообщалось об ассоциации этих ST с mcr-1. Разнообразные ST демонстрировали генетическую гетерогенность, что также наблюдалось в других сообщениях о продуцирующей MCR-1 E. coli (Veldman и др., 2016; Wang и др., 2016). Эти данные свидетельствуют о сложном генетическом разнообразии как гена mcr-1, так и его хозяев — E. coli — в почвах Китая. Как следствие, существует настоятельная необходимость в разработке комплексной стратегии для предотвращения дальнейшего распространения mcr-1 среди изолятов с множественной лекарственной устойчивостью. Изоляты E38, E43 и E47 демонстрировали высокосходные профили, что указывает на клональность этих продуцирующих MCR-1 штаммов (рисунок 1). S1-PFGE и гибридизация показали, что продуцирующие MCR-1 изоляты имели множественные плазмиды размером от 30 до 250 т.п.н. (рисунок 2A). Более того, ген mcr-1 был локализован на плазмиде размером 220 т.п.н. у изолятов E11 и E24. Интересно, что саузерн-блоттинг и эксперименты по конъюгации дали отрицательные результаты для E4, E38, E43 и E47, что указывает на хромосомное кодирование гена mcr-1 у этих изолятов (рисунок 2B и дополнительная таблица S3). Хромосомные гены mcr-1 также были обнаружены в предыдущих исследованиях (Falgenhauer и др., 2016; Li и др., 2016). Наше исследование выявило неожиданное разнообразие штаммов, содержащих mcr-1, присутствующих в исследованных почвенных образцах.

РИСУНОК 1 Молекулярные и генотипические профили шести продуцирующих mcr-1 изолятов Escherichia coli из почв сельскохозяйственных угодий. Сводка молекулярно-эпидемиологических характеристик шести продуцирующих mcr-1 изолятов E. coli. Дендрограмма PFGE-паттернов построена с использованием BioNumerics v6.6 с кластеризацией UPGMA. Масштабная линейка показывает процент генетического родства.

РИСУНОК 2 (A) Плазмидные профили шести mcr-1-положительных изолятов, полученные с использованием рестрикционного фермента S1, с Salmonella enterica серовар Branderup в качестве маркера молекулярной массы. (B) Саузерн-блот-гибридизация со специфичным к mcr-1 зондом. Использованы праймеры MCR-F1 (5′-TGCAGCATACTTCTGTGTGGT-3′) и MCR-R1 (5′-CACCGAGTAGATTGGCATGA-3′).

Китай ежегодно производит приблизительно 2,1 триллиона кг свинины и мяса птицы (Zhou и др., 2016). До запрета китайским правительством использования колистина в качестве кормовой добавки для животных с 1 ноября 2016 года потребление колистина составляло более 8000 тонн (Walsh и Wu, 2016). Долгосрочное использование огромных количеств колистина могло создать селективное давление, способствующее возникновению и распространению устойчивых к колистину изолятов в фекалиях, особенно у кур, поскольку противомикробные препараты часто вводились этим животным перорально (Nguyen и др., 2016). Как и следовало ожидать, устойчивые к колистину штаммы были широко обнаружены в образцах фекалий сельскохозяйственных животных в Китае (Bai и др., 2016). Насколько нам известно, на сегодняшний день нет сообщений о выделении mcr-положительных энтеробактерий из почвенных образцов. Однако mcr-положительные E. coli были идентифицированы в речной воде, образцах овощей (Zurfuh и др., 2016) и сточных водах (Ovejero и др., 2017). Интересно, что в одном исследовании изучалась передача бактерий, содержащих mcr-1, в окружающую среду вокруг фермерских районов в Германии, и были обнаружены семь mcr-1-положительных штаммов E. coli, происходящих из экологических тампонов для обуви, фекалий собак, мух-жигалок и навоза (Guenther и др., 2017). Более актуально то, что недавний отчет показал, что продуценты mcr-1 были идентифицированы в питьевой воде из провинции Шаньдун (Sun P. и др., 2017). Примечательно, что в сельских районах Китая, особенно в районах с интенсивным животноводством, животный навоз широко используется в качестве органического удобрения (Zhu и др., 2013). Эти данные согласуются с нашими результатами, хотя вклад путей загрязнения почвы в распространение бактерий, содержащих mcr-1, требует дополнительных исследований. Наши данные свидетельствуют о возможном загрязнении почвы бактериями, несущими ген mcr-1, из животного навоза, поскольку в нашем исследовании все выделенные продуценты mcr-1 были получены из района с интенсивным животноводством.

Геномные особенности продуцирующих MCR-1 изолятов

Полногеномное секвенирование дало 4 717 954, 5 886 228, 4 302 436, 5 043 375, 4 164 486 и 5 989 082 пар прочтений длиной 150 п.н. для E4, E11, E24, E38, E43 и E47 соответственно. Сборка геномов этих изолятов привела к получению 109, 179, 124, 116, 119 и 113 контигов размером более 500 п.н., составляющих 4,9 мегабаз последовательности и представляющих среднее 309-кратное покрытие (дополнительная таблица S4).

Широкое использование антибиотиков в животноводстве приводит к загрязнению фекалий и мочи животных исходным противомикробным соединением и MDR-бактериями, что приводит к загрязнению почв сельскохозяйственных угодий ARG (Xu и др., 2015). Все секвенированные mcr-1-положительные изоляты, обнаруженные в этом исследовании, несли множественные гены резистентности, обусловливающие множественную лекарственную устойчивость, и множественные Inc-типы плазмид, что свидетельствует о наличии множественных плазмид, что согласуется с результатами нашего плазмидного профилирования (рисунок 2). Гены blaTEM-1B, floR и sul1, а также гены устойчивости к аминогликозидам [aac(6′)Ib-cr, aph(3′)-Ia или aadA] были обнаружены во всех mcr-1-положительных штаммах E. coli; эти данные объясняют фенотип обширной лекарственной устойчивости этих изолятов E. coli (рисунок 1 и дополнительная таблица S1). Штаммы E38, E43 и E47 были генетически близкородственны; это наблюдение согласуется с нашими данными по PFGE-профилям, что указывает на распространение гена mcr-1 за счет изолятов. Интересно, что изоляты E11 и E24 имели одинаковые Inc-типы плазмид, хотя результаты PFGE показали их относительную гетерогенность, что указывает на распространенность плазмид, несущих mcr-1, в этом районе с интенсивным животноводством, и их широкий круг хозяев, что способствует диссеминации гена mcr-1 (рисунки 1, 2). Недавнее исследование также показало, что глобальное распространение mcr-1 в основном опосредовано высокопромисскуитивными плазмидами, а не несколькими популяциями клонов, несущих mcr-1 (Matamoros и др., 2017). Клоны могут обладать внутренней способностью приобретать гены устойчивости к противомикробным препаратам, включая mcr-1, что позволяет им играть потенциальную роль резервуара для этого гена и способствовать распространению гена mcr-1 в локальных регионах.

Мы идентифицировали плазмидные репликоны во всех шести изолятах, включая один тип плазмиды у E4, три типа плазмид у E11 и четыре типа плазмид у E24, E38, E43 и E47. С помощью BLAST-анализа плазмидных последовательностей, собранных с помощью plasmidSPAdes, мы также обнаружили семь различных типов плазмид в этих штаммах, что согласуется с результатами S1-PFGE (рисунок 2A). У изолята E11 mcr-1 находился на плазмиде IncHI2. Поиск в базе данных nr/nt показал гомологию последовательностей между собранным крупным плазмидным контигом (60,4 т.п.н.) и аннотированной mcr-1-положительной плазмидой IncHI2 pHNSHP45-2 (GenBank: KU341381) (дополнительный рисунок S2A). Для изолята E24 было обнаружено, что контиг, содержащий mcr-1 (37,5 т.п.н.), на 99% идентичен mcr-1-положительной плазмиде IncHI2 pMR0516mcr (GenBank: KX276657) (дополнительный рисунок S2B). Примечательно, что последовательность участка pap2-mcr-1-ISApl1 была идентифицирована в обеих плазмидах, что обычно встречается в плазмидах, несущих mcr-1 (Wang и др., 2017). Кроме того, генетический контекст хромосомно кодируемых генов mcr-1 был сходен с описанным в предыдущем исследовании, т.е. mcr-1 наблюдался в структуре, состоящей из ISApl1-IRR-mcr-1-hp (дополнительный рисунок S3) (Sun J. и др., 2017). ISApl1 является членом семейства IS30 и способствует мобилизации кассеты mcr-1 в хромосому посредством распознавания различных родственных IRR, которые могут идеально соответствовать 3′-концу mcr-1-hp для формирования кольцевого интермедиата (Dona и др., 2017; Sun J. и др., 2017).

Насколько нам известно, данное исследование представляет собой первое обследование MCR-1 у продуцирующих ESBL изолятов E. coli из почв сельскохозяйственных угодий. Хорошо известно, что ген mcr-1 может распространяться через пищевые цепочки. Данное исследование дополнительно подчеркивает возможность того, что mcr-1 может попадать к человеку через загрязнение почвы и тем самым угрожать общественному здоровью. Показатели носительства mcr-1, вероятно, будут быстро расти в исследованном регионе из-за загрязнения окружающей среды mcr-1, описанного в данной работе и в предыдущем исследовании (Sun P. и др., 2017). Поэтому исследования, посвященные влиянию внесения животного навоза на передачу продуцентов mcr-1, имеют большое значение, и в Чжучэне и прилегающих районах необходим усиленный межсекторальный надзор за устойчивой к колистину E. coli.

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2017.02510/full#supplementary-material

¹ http://www.eucast.org

Zheng B, Huang C, Xu H, Guo L, Zhang J, Wang X, Jiang X, Yu X, Jin L, Li X, Feng Y, Xiao Y and Li L (2017) Occurrence and Genomic Characterization of ESBL-Producing, MCR-1-Harboring Escherichia coli in Farming Soil. Front. Microbiol. 8:2510. doi: 10.3389/fmicb.2017.02510

Перевод статьи «Occurrence and Genomic Characterization of ESBL-Producing, MCR-1-HarboringEscherichia coliin Farming Soil» авторов Zheng B, Huang C, Xu H, Guo L, Zhang J, Wang X, Jiang X, Yu X, Jin L, Li X, Feng Y, Xiao Y and Li ., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык

Фото: Designed by Freepik