Пробиотические бактерии повышают яйценоскость в птицеводстве

Антимикробная резистентность (АМР) является одной из самых серьезных угроз для здоровья человека в ближайшем будущем. Животноводство сыграло важную роль в появлении антибиотикорезистентных бактерий, кишечном дисбиозе у сельскохозяйственных животных и распространении АМР среди патогенных бактерий, значимых для человека. Разработка альтернатив, таких как пробиотики, направлена на поддержание или повышение уровня продуктивности при одновременном снижении негативных последствий применения антибиотиков.

С этой целью мы добавляли потенциальный пробиотик Enterococcus faecalis UGRA10 в рацион кур-несушек в конечной концентрации 10⁸ колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г) корма. Его воздействие было проанализировано путем: (i) изучения реакции микробиома подвздошной и слепой кишки; и (ii) анализа влияния на яйценоскость. Во второй половине экспериментального периода (с 40-го по 76-й день) куры, получавшие E. faecalis UGRA10, сохраняли яйценоскость, тогда как у контрольных животных продуктивность снизилась. Добавление E. faecalis UGRA10 в рацион значительно повысило бактериальное разнообразие в подвздошной и слепой кишке кур-несушек (большее богатство операционных таксономических единиц и индекс разнообразия Фейта), при этом у животных на одинаковом рационе наблюдалось большее сходство микробного состава. Эти результаты указывают на благотворное влияние E. faecalis UGRA10 на яйценоскость. Для выяснения механизмов, лежащих в основе положительной реакции животных на данное лечение, необходимы дальнейшие эксперименты.

Возникновение антимикробной резистентности (АМR) является глобальной проблемой общественного здравоохранения (Ferri et al., 2017; World Health Organization, 2018). Такая ситуация сложилась из-за необоснованного назначения антибиотиков, их неправильного использования пациентами и злоупотребления этими веществами в животноводстве (Hecker et al., 2003; Levy and Marshall, 2004; Capita and Alonso-Calleja, 2013). Бесконтрольное применение антибиотиков в животноводстве обусловлено двумя основными причинами. Первая и наиболее очевидная — контроль заболеваний, связанный с интенсивным животноводством и перенаселенностью животных (McEwen and Fedorka-Cray, 2002; Gilchrist et al., 2007; Marshall and Levy, 2011). Вторая причина — открытие эффекта антибиотиков как стимуляторов роста (AGPs, рассмотрено в McEwen and Fedorka-Cray, 2002; Dibner and Richards, 2005). Хотя механизмы действия остаются неясными, антибиотический дисбаланс изменяет бактериальные сообщества кишечника, вызывает нарушения в пищеварительном тракте и метаболических процессах, а также повышает всасывание питательных веществ (Dibner and Richards, 2005; Miles et al., 2006; Niewold, 2007). Кроме того, антибиотики влияют на иммунную систему — как через изменения в бактериальном сообществе, так и непосредственно изменяя иммунный ответ (Bode et al., 2014; Yang et al., 2017). Поэтому одним из бактериальных сообществ, наиболее подверженных воздействию антибиотиков, является кишечный микробиом (McEwen and Fedorka-Cray, 2002; Wegener, 2003). Эти бактерии играют фундаментальную роль в гомеостазе кишечника, его сбалансированности и устойчивости (Clemente et al., 2012; Huttenhower et al., 2012). Однако появление нежелательных побочных эффектов, особенно влияющих на распределение и отбор генов АМR у комменсальных бактерий, делает эти бактерии опасными для здоровья человека (Wegener, 2003) и обусловливает необходимость поиска альтернатив использованию антибиотиков в животноводстве (Ferket, 2004).

Антибиотики сыграли важную роль в максимизации производства птицеводческой продукции (McEwen and Fedorka-Cray, 2002; Dibner and Richards, 2005). Таким образом, они использовались как стимуляторы роста у бройлеров (Gadde et al., 2018; Wealleans et al., 2018) или как усилители яйценоскости у кур-несушек (Park et al., 2016). Это повышение продуктивности связывали с благотворной ролью антибиотиков в контроле инфекций на птицефермах (Gustafson and Bowen, 1997; McEwen and Fedorka-Cray, 2002; Singer and Hofacre, 2006). Однако появились нежелательные и побочные эффекты, особенно влияющие на изменения в распределении и отборе генов АМR у комменсальных бактерий (Teuber, 2001; Diarra et al., 2007; Diarrassouba et al., 2007; Gyles, 2008). Некоторые данные свидетельствуют о появлении АМR в связи с использованием антибиотиков в птицеводстве. Была подтверждена взаимосвязь между применением фторхинолонов и АМR у Campylobacter sp. (Alfredson and Korolik, 2007; Nelson et al., 2007). Полирезистентные штаммы Escherichia coli были связаны с птицефермами и обнаружены в продуктах, полученных от кур (Diarra et al., 2007; Diarrassouba et al., 2007; Thibodeau et al., 2007; Gyles, 2008; Osman et al., 2018). Несколько исследований указывают на птицу и производные продукты питания как на резервуар и потенциальный источник резистентных штаммов Salmonella sp. (Carramiñana et al., 2004; de Oliveira et al., 2005; Singh et al., 2010; Velasquez et al., 2018). В условиях распространения АМR правительства и институты начали запрещать использование антибиотиков в животноводстве (European Commission, 2003, 2005; U.S. FDA, 2017). Однако запрет на антибиотики в животноводстве в целом, и в птицеводческом секторе в частности, вызвал рост заболеваемости инфекциями, вызванными Campylobacter jejuni или Clostridium perfringens (рассмотрено в Van Immerseel et al., 2004; Alfredson and Korolik, 2007). Поэтому существует значительная обеспокоенность и определенная необходимость замены антибиотиков в контроле заболеваний и в качестве стимуляторов роста (Joerger, 2003; Griggs and Jacob, 2005).

В качестве заменителей антибиотиков в птицеводстве предлагались различные агенты, такие как пребиотики и пробиотики (Patterson and Burkholder, 2003; Gaggia et al., 2010). Большинство пробиотиков, используемых в птицеводстве, представляют собой бактерии, уже присутствующие в пищеварительном тракте животных, и обладают полезными свойствами как модуляторы сигналов кишечных клеток, стабилизаторы бактериальных сообществ или конкуренты против нежелательных видов бактерий (de Vrese and Schrezenmeir, 2008; Kabir, 2009). Хотя виды Enterococcus не считаются «общепризнанно безопасными» (GRAS, рассмотрено в Ogier and Serror, 2008), различные виды Enterococcus были протестированы в качестве пробиотиков (Fuller, 1989; Franz et al., 2011). Использование энтерококков в качестве пробиотиков остается спорным: в то время как пробиотические преимущества некоторых штаммов хорошо установлены, рост энтерококковых заболеваний, связанных со здоровьем человека, и устойчивость к множественным антибиотикам вызывают опасения относительно их применения (Franz et al., 2003). Несмотря на эту противоречивость, некоторые штаммы коммерциализируются как пробиотики, такие как Enterococcus faecium SF68 (Cylactin, F. Hoffmann-Roche, S.A., Switzerland) и Enterococcus faecalis (Symbioflor, SymbioPharm, Germany) (Habermann et al., 2001; Fenimore et al., 2017; Torres-Henderson et al., 2017). E. faecalis была отмечена как потенциальный заменитель антибиотиков (Gaggia et al., 2010). E. faecalis — это распространенная бактерия в кишечнике позвоночных, грамположительная, факультативный анаэроб, обладающая высокой степенью устойчивости к pH (3–10) и солености [6,5% NaCl (вес/объем)] (Krieg and Holt, 1984; Schleifer and Kilpper-Bälz, 1984), что позволяет проходить через желудочно-кишечный тракт в толстую кишку. Более того, они являются хорошими продуцентами антагонистических веществ, особенно бактериоцинов, также называемых энтероцинами, что обеспечивает значительное взаимодействие с остальной частью сообщества (Foulquie-Moreno et al., 2006; Martín-Platero et al., 2006; Trmcic et al., 2011). В этом смысле штамм E. faecalis UGRA10, выделенный из андалузского козьего сыра, является продуцентом энтероцина AS-48 и обладает очень интересными технологическими свойствами: устойчив к высоким концентрациям желчи [до 40% (вес/объем)]; проявляет широкий антагонистический спектр, включая грамотрицательные и грамположительные бактерии (Cebrian et al., 2012), и, по-видимому, стимулирует иммунный ответ у животных (Baños, 2016). Интересно, что этот штамм безвреден для мышей и рыб и защищает от некоторых патогенных штаммов, таких как C. perfringens у мышей и Lactococcus garvieae у радужной форели и зебр (Baños, 2016). Эти свойства делают E. faecalis UGRA10 отличным кандидатом в пробиотики и моделью для изучения его колонизации, влияния на сообщество и, особенно, на здоровье и продуктивность животных.

Мы исследовали возможное влияние E. faecalis UGRA10 на яйценоскость и кишечный микробиом кур-несушек при добавлении в рацион, сочетая классические методы культивирования с новейшим высокопроизводительным секвенированием.

Куры-несушки и условия содержания

Эксперимент проводился на птицефабрике Granja Avícola Gil, SL (Альендин, Гранада, Испания). Куры-несушки содержались при температуре 20 ± 2°C и относительной влажности 78 ± 3% (среднее ± стандартное отклонение), при фотопериоде 16 часов в сутки. Ферма соответствовала национальным нормам и Европейской директиве по защите благополучия животных в исследованиях (Директива 2010/63/EU, European Commission, 2010).

Экспериментальный дизайн и сбор образцов

Три производственные линии содержали 180 экспериментальных кур-несушек группами по 6 особей в клетке, с кормом и водой ad libitum. Все куры-несушки принадлежали к одной линии Hy Line brown и были размещены в клетках в возрасте 16 недель. Распределение клеток между лечебными группами было случайным образом распределено по трем производственным линиям. Куры содержались и получали корм в течение 2 недель для акклиматизации.

Контрольные куры (90 кур, 15 клеток) получали базовый комбикорм (45% рыбной муки, 35% сои, 8% гранулированной кукурузы, 7% кукурузных отрубей и 5% подсолнечного хлеба), в то время как экспериментальные куры (90 кур, 15 клеток) получали тот же рацион, но дополненный бактерией E. faecalis UGRA10 (см. ниже).

Куры сначала содержались на ферме в течение 15 дней для акклиматизации. Эксперимент начался 8 апреля, и яйценоскость (количество яиц) каждой лечебной группы регистрировалась каждый рабочий день до 76-го дня. На этой экспериментальной ферме кур-несушек забивают после 76 дней. Один раз в неделю яйца от каждой лечебной группы взвешивались и классифицировались по размерным категориям (S: <53 г; M: 53–63 г; L: 63–73 г; XL; >73 г) согласно регламенту ЕС (European Commission, 2008). Образцы фекалий собирались на 7-й, 15-й, 40-й и 76-й дни эксперимента. На 40-й день 13 кур из каждой группы были подвергнуты эвтаназии внутригрудной инъекцией 2 мл/курица эвтаназийного препарата T-61 (Intervet, Саламанка, Испания). На 76-й день 10 кур из каждой группы были подвергнуты эвтаназии по аналогичной процедуре. Сразу после забоя кур вскрывали, и подвздошную и слепую кишки собирали стерильным материалом, помещали в стерильные пластиковые пакеты и транспортировали непосредственно в лабораторию, где образцы обрабатывались. За время эксперимента ни одно животное не погибло от болезни или недоедания.

Производство E. faecalis UGRA10

Enterococcus faecalis UGRA10 был выделен исследовательской группой по микробному антагонизму Гранадского университета (Cebrian et al., 2012). Бактерии культивировали в биореакторах на мощностях DMC Research, расположенных в Альендине (Гранада, Испания), как побочный продукт производства бактериоцина AS-48. Кратко: штамм культивировали из запаса при -80°C на триптиказо-соевом агаре (Scharlau, S.L., Spain), и изолированные колонии инокулировали в 2 л бульона Brain Heart Infusion (BHI, Scharlau, S.L., Spain) и инкубировали при 28°C в течение 24 часов. Этот первичный инокулят добавляли (5%) в бульон на основе Lactoalbumin Esprion 300 (E-300, DMW International, Holland), как описано в Ananou et al. (2008), в 20-литровый биоферментер (Biobech 20 Applikon Biotechnology, Делфт, Нидерланды), а затем инкубировали при 28°C в течение 24 часов. После этого 16 л этой культуры добавляли в 300 л Lactoalbumin Esprion 300 в ферментере CHEMAP (Compact Unit, Process Engineering Company, India) и инкубировали при 29°C в течение 24 часов. Все инокуляты и бульоны были доведены до pH 6,5. Клетки собирали с помощью ультрафильтрационного оборудования M-500 (BionetIngenieria, Spain). После этого клетки ресуспендировали в солевом буфере и дважды рецентрифугировали. Конечные чистые осадки хранили при -20°C.

Клетки инкапсулировали в β-циклодекстриновые микроструктуры и хранили при 4°C до 15 дней. β-циклодекстрин является отличным транспортным агентом благодаря отсутствию значительного воздействия на хозяев (Del Valle, 2004). Для изучения жизнеспособности клеток, включенных в β-циклодекстрин, мы культивировали десятичные разведения трех образцов этих микроструктур (1 г образца, разведенного в 10 мл фосфатного буфера) в разные временные интервалы (0, 7, 15 и 30 дней хранения) на TSA и инкубировали при 37°C в течение 48 часов. Жизнеспособность клеток снижалась через 15–30 дней хранения (Kruskal–Wallis, H2,11 = 9.36, P = 0.025). Следуя консервативной стратегии, β-циклодекстриновый комплекс производился каждые 15 дней для обеспечения жизнеспособности клеток. Микроструктуры UGRA10-β-циклодекстрина смешивали с кормом экспериментальных кур-несушек в конечной концентрации 10⁸ колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г) корма. Пробиотик вводили ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Подсчет микроорганизмов в образцах фекалий

После доставки в лабораторию образцы фекалий взвешивали, переносили в лабораторные смесительные пакеты и разводили в 10 раз в фосфатном солевом буфере с добавлением 0,5 г/л гидрохлорида цистеина (для обеспечения жизнеспособности анаэробных бактерий). Образцы гомогенизировали с помощью лабораторного смесителя (IUL Instruments, Spain) в течение 2 минут. Для каждого лечения и временной точки отбора проб (7, 15, 40 и 76 дней) собирали три набора образцов. Каждый набор состоял из смеси семи образцов фекалий из разных клеток с одинаковым лечением.

Десятичные разведения каждого набора были выполнены и культивированы в трех повторностях на агаре Wilkins-Chalgren для общих анаэробных бактерий (Scharlau, S.L., Spain) и агаре Slanetz-Bartley для Enterococcus sp. (Scharlau, S.L., Spain). Чашки инкубировали при 37°C в течение 48 часов в 2,5-литровых анаэробных камерах (Oxoid) и системе 2,5 л AnaeroGen Compact (Thermo Scientific). Бактериальные колонии выражали как КОЕ/г на грамм образца фекалий.

Непрямое обнаружение E. faecalis UGRA10 в образцах фекалий

Мы проверили ингибирующую способность изолятов из образцов фекалий против двух индикаторных штаммов, E. faecalis S-47 и E. faecalis UGRA10. Мы ожидали, что популяция Enterococcus в фекалиях обработанной группы будет доминировать E. faecalis UGRA10, поэтому большинство изолятов будут продуцировать гало ингибирования против S-47 (Cebrian et al., 2012). Однако эти гало будут исчезать в присутствии исходного штамма из-за того, что E. faecalis UGRA10 иммунен к собственному бактериоцину (Cebrian et al., 2012).

Индикаторные штаммы культивировали из запаса лаборатории молочнокислых бактерий Гранадского университета. После выделения на агаре Brain Heart Infusion (BHA) колонии культивировали в течение ночи в 6 мл BHI. Антагонистическую активность тестировали согласно Tagg and Mcgiven (1971). Стальные цилиндры для антибиотиков (диаметр: 8 мм, высота: 10 мм; Scharlab, S.L.) помещали на слой 10 мл агара Müller-Hilton (Scharlau, S.L.), забуференного фосфатным солевым буфером (pH 7,2, M = 0,2). После этого 6 мл BHA (Scharlau, S.L.), охлажденного до примерно 55°C, инокулировали одним из индикаторных штаммов (около 10⁸ КОЕ на мл), встряхивали на вортексе и распределяли поверх агара Müller-Hilton. После застывания BHA цилиндры удаляли, оставляя круглое отверстие в слое BHA.

С чашек с агаром Slanetz-Bartley мы случайным образом отбирали по 320 колоний с чашек для каждого лечения и временной точки отбора (2 лечения × 4 времени отбора × 40 колоний). Каждую колонию инкубировали в течение ночи в пробирках с 6 мл BHI, 1 мл центрифугировали и 100 мкл супернатанта добавляли в отверстия. Чашки инкубировали в течение 18–24 часов при 37°C. Ингибирующую активность измеряли как наличие или отсутствие гало ингибирования.

Высокопроизводительное секвенирование

Тотальную бактериальную ДНК из образцов подвздошной и слепой кишки экстрагировали по модифицированной процедуре высаливания Martín-Platero et al. (2007). Ампликонную ПЦР проводили из тотальной бактериальной ДНК на V4 области гена 16S рРНК с использованием праймеров 515f (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) – 786r (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) с кодами Golay на прямом праймере. Высокопроизводительное секвенирование проводили на платформе Illumina Miseq в Научно-инструментальном центре Гранадского университета (Испания). Подвздошная и слепая кишки 5 контрольных и 10 обработанных кур использовались в последующих анализах для обоих временных точек отбора (на 40-й и 76-й дни). Шесть образцов не дали амплификации (см. распределение в Дополнительной таблице S1). Последовательности доступны в Sequence Read Archive (SRA) на веб-странице GenBank – NCBI¹ под номерами доступа SAMN09603288–SAMN9603361.

Последующие анализы выполняли с помощью QIIME2 v2018.02 (Quantitive Insights In Microbial Ecology, Caporaso et al., 2010). Обрезку праймеров, объединение пар и фильтрацию качества выполняли с использованием параметров по умолчанию. После этого мы использовали Deblur, подход суб-операционных-таксономических-единиц (sOTU), для удаления ошибок секвенирования (Amir et al., 2017). Мы использовали скрипт вставки фрагментов, реализованный в QIIME2, который выполняет выравнивание последовательностей и создание филогенетического дерева de novo (Janssen et al., 2018). Таксономическую принадлежность определяли на основе Greengenes 13_08 со сходством 99% (DeSantis et al., 2006). Наконец, хлоропласты и митохондрии были удалены из таблицы sOTU, но Cyanobacteria были сохранены в последующих анализах (Ley et al., 2005).

Статистический анализ

Мы использовали общие линейные модели (GLM) для изучения влияния лечения, даты отбора проб и их взаимодействия на различные зависимые переменные: бактериальные культуры, количество яиц (Дополнительная таблица S2) и различные индексы альфа-разнообразия. Мы также исследовали влияние размера яйца как фактора (S, M, L или XL, как описано выше). Whitaker (1972) определил разнообразие на трех разных уровнях: альфа-разнообразие — это разнообразие, обнаруженное в образце; бета-разнообразие — это композиционное различие между образцами; а гамма-разнообразие — это разнообразие на региональном уровне. Мы рассчитали три различных индекса альфа-разнообразия из таблицы sOTU: бактериальное таксономическое разнообразие (OTU richness, или количество наблюдаемых OTU), филогенетический индекс разнообразия Faith (Faith and Baker, 2006) и chao1 (Chao, 1984). Остатки зависимых переменных после анализа соответствовали нормальному распределению (тест на нормальность Колмогорова–Смирнова; P > 0,20) и были гомоскедастичны (тест Ливена на однородность дисперсий, все P > 0,19). Эти результаты подтверждают обоснованность использования параметрических статистических тестов. Эти анализы выполнялись в программе Statistica 10.0.

Матрицы расстояний бета-разнообразия рассчитывались с использованием расстояния Unifrac (Lozupone and Knight, 2005) на основе рарифицированной таблицы sOTU с глубиной 1800 последовательностей на образец. Как взвешенные, так и невзвешенные матрицы расстояний Unifrac использовались в последующих анализах, поскольку у нас не было априорных предположений о влиянии независимых переменных (лечение, дата отбора и отдел кишечника) на бактериальное сообщество. Взвешенный Unifrac придает большее значение наиболее распространенным бактериям, поскольку учитывает численность последовательностей на sOTU, в то время как невзвешенный Unifrac придает одинаковый вес всем бактериальным sOTU, присутствующим в образцах, то есть придает большее значение минорным бактериям, поскольку учитывает наличие или отсутствие sOTU. Для проверки этих эффектов на обеих матрицах расстояний Unifrac использовали Procrustes ANOVA (Collyer et al., 2015) с использованием пакетов geomorph (Adams and Otarola-Castillo, 2013) и vegan (Oksanen et al., 2016). Были выполнены анализы главных координат (Principal Coordinate Analyses), и визуализация первых трех осей PCoA была построена с использованием Emperor 2018.2.0 (Vazquez-Baeza et al., 2013).

Альфа-разнообразие бактериального сообщества в подвздошной и слепой кишке

Микробиом подвздошной кишки контрольных кур как на 40-й, так и на 76-й день на уровне классов был представлен Clostridia, Bacteroidia, Erysipelotrichi, Mollicutes, Deltaproteobacteria и Bacilli (Рисунок 1 и Дополнительный рисунок S1). Эти доминирующие классы присутствовали у кур, обработанных E. faecalis UGRA10, на 40-й день, хотя пропорции каждого класса изменились, и класс Clostridia стал единственным доминирующим (Рисунок 1 и Дополнительный рисунок S1). Сообщество подвздошной кишки у контрольных кур было очень разнообразным на уровне родов, с доминированием Desulfovibrio, Bacteroides, неизвестного рода порядка Bacteroidales, неизвестного рода семейства Ruminococcaceae и неизвестного рода семейства Mogibacteriaceae (Дополнительный рисунок S2). Бактериальное сообщество образцов от кур, обработанных E. faecalis UGRA10, было очень похожим, хотя появились другие доминирующие роды, такие как Phascolarctobacterium или Megamonas (Дополнительный рисунок S2).

РИСУНОК 1 Столбчатые диаграммы средней относительной численности бактерий в отделах кишечника кур-несушек на уровне классов, сгруппированные по времени отбора проб и лечению. Классы в легенде отсортированы по относительной численности последовательностей — от наиболее обильных к наименее обильным. UGRA обозначает кур, получавших Enterococcus faecalis UGRA10 в концентрации 10⁸ КОЕ на грамм корма в день; 40 и 76 обозначают количество дней после начала эксперимента.

Бактериальное OTU-богатство в подвздошной кишке значительно различалось между лечебными группами на протяжении экспериментального периода (Таблица 1). В то время как группа E. faecalis UGRA10 сохраняла сходные уровни бактериального OTU-богатства, контрольная группа показала увеличение OTU-богатства, достигнув на 76-й день уровней, сходных с группой лечения (Рисунок 2 и Дополнительная таблица S3). Аналогичная тенденция была погранично значимой для индекса разнообразия Faith (см. член взаимодействия в индексе разнообразия Faith в подвздошной кишке, Таблица 1).

Таблица 1 Общие линейные модели, исследующие влияние лечения (контроль и введение E. faecalis UGRA10) и времени отбора проб (дни 40 и 76) на различные индексы альфа-разнообразия бактериального сообщества подвздошной и слепой кишки кур-несушек.

D.f. означает степени свободы. Значимые значения P выделены жирным шрифтом.

РИСУНОК 2 Среднее ± стандартная ошибка среднего бактериального OTU-богатства (количество различных OTU) подвздошной кишки кур-несушек в разные сроки отбора проб (в днях) у контрольных (n = 5, красный) и кур, получавших добавку E. faecalis UGRA10 (n = 10, синий).

Бактериальное сообщество слепой кишки было более разнообразным, чем подвздошной кишки (Рисунок 1 и Дополнительный рисунок S1). Основные классы на 40-й и 76-й дни в обеих экспериментальных группах включали Clostridia, Deltaproteobacteria, Bacteroidia и неизвестный тип OP8 (Рисунок 1 и Дополнительный рисунок S1). Обилие родов между лечебными группами и датами отбора следовало сходным закономерностям. Бактериальное сообщество характеризовалось доминированием Phascolarctobacterium, Fusobacterium, Desulfovibrio, неизвестного рода, принадлежащего к классу Cyanobacteria, и Megamonas (Дополнительные рисунки S2A,B). Альфа-разнообразие было очень сходным между лечебными группами, без значительных изменений на протяжении экспериментального периода (Таблица 1).

Влияние лечения и даты отбора проб на бета-разнообразие

В области подвздошной кишки изменения бактериальных сообществ в течение экспериментального периода варьировали в зависимости от лечения (см. Рисунок 3 и член взаимодействия в Таблице 2). Интересно, что контрольные сообщества на 76-й день перекрывались с бактериальными сообществами лечения E. faecalis UGRA10.

РИСУНОК 3 Двумерные графики, показывающие первые три оси анализа главных координат и представляющие бактериальные сообщества подвздошной кишки кур-несушек, с использованием матриц расстояний невзвешенного и взвешенного Unifrac. Показана также доля объясненной дисперсии каждой осью PCo.

Таблица 2 PROCRUTES ANOVA, исследующий влияние лечения, даты отбора проб и их взаимодействия на бактериальное сообщество кур-несушек, получавших контрольный рацион или рацион с добавлением Enterococcus faecalis UGRA10.

D.f. означает степени свободы. Значимые значения P выделены жирным шрифтом.

Лечение объясняло значительную долю дисперсии в бактериальном сообществе слепой кишки (как взвешенный, так и невзвешенный Unifrac), и его эффект зависел от даты отбора проб (см. член взаимодействия на Рисунке 4 и в Таблице 2).

РИСУНОК 4 Двумерные графики, показывающие первые три оси анализа главных координат, представляющие бактериальные сообщества слепой кишки кур-несушек, с использованием матриц расстояний невзвешенного и взвешенного Unifrac. Показана также доля объясненной дисперсии каждой осью PCo.

Присутствие E. faecalis в фекалиях

Культуры из каждого образца были высоко и значимо скоррелированы в пределах каждой трехкратной повторности (Kruskal–Wallis, бактериальный подсчет как зависимая переменная, образец как фактор, H23,72 = 62,44, P < 0,001), поэтому мы рассчитали средние значения для каждого набора образцов в пределах каждой даты отбора и каждой бактериальной культуры.

Enterococcus sp. был успешно выделен со всех чашек с агаром Slanetz-Bartley [контроль, N = 72, log10 КОЕ = 6,55 ± 0,16 (среднее ± SE); E. faecalis UGRA10: N = 72, 6,67 ± 0,20]. Однако лечение, дата отбора или их взаимодействие не объясняли значительной вариации в количестве Enterococcus sp. (GLM, среднее бактериальное количество, лечение как фактор, F1,20 = 0,01, P = 0,915, время отбора как ковариата, F1,20 = 2,15, P = 0,158, взаимодействие, F1,20 = 0,13, P = 0,721).

Следуя аналогичной закономерности, общие анаэробные бактерии (контроль, N = 72, log10 КОЕ = 7,27 ± 0,99; E. faecalis UGRA10: N = 72, 7,40 ± 0,86) не различались между лечебными группами, датами отбора или их взаимодействием (GLM, среднее бактериальное количество, лечение как фактор, F1,20 = 0,05, P = 0,827, время отбора как ковариата, F1,20 = 0,58, P = 0,454, взаимодействие, F1,20 < 0,01, P = 0,990).

Непрямое обнаружение E. faecalis UGRA10 в фекалиях

Процент колоний, проявляющих ингибирующие свойства против E. faecalis S-47, увеличивался на протяжении эксперимента, но только в группе лечения. В контрольной группе низкий процент колоний проявлял антагонизм против S-47 (Таблица 3). Интересно, что большинство колоний, продуцирующих антагонизм против E. faecalis S-47 в группе лечения, не проявляли ингибирования против E. faecalis UGRA10, за исключением 1 из 30 колоний на 80-й день. Большинство этих колоний можно отнести к E. faecalis UGRA10, поскольку этот штамм иммунен к собственному бактериоцину (Таблица 3).

Таблица 3 Проценты колоний из образцов фекалий кур-несушек, проявивших ингибирование против индикаторного штамма E. faecalis S-47, и процент тех колоний, у которых гало ингибирования исчезало против E. faecalis UGRA10.

Яйценоскость

Поскольку 13 кур были забиты на 40-й день, мы анализировали оба периода отдельно: до и после забоя. Яйценоскость сохранялась в первой половине эксперимента независимо от лечения (Рисунок 5A и Таблица 4), так как оба наклона яйценоскости не отличались от 0 (наклон контрольной группы = -0,007, r = -0,02, P > 0,915; наклон экспериментальной группы = -0,09; r = -0,24; P = 0,277). Однако яйценоскость во втором периоде значительно различалась между лечебными группами. В то время как яйценоскость контрольных кур значительно снижалась (наклон = -0,15, r = -0,51, P = 0,020), куры, получавшие добавку E. faecalis UGRA10, сохраняли яйценоскость на протяжении этого периода (наклон = 0,07, r = 0,24, P = 0,293; Рисунок 5B и Таблица 4).

РИСУНОК 5 Корреляции между количеством яиц и датой отбора проб в зависимости от лечения в течение первой (A) и второй (B) половины экспериментального периода. Контрольные куры (красный) получали базовый рацион, в то время как экспериментальные куры (синий) получали добавку E. faecalis UGRA10.

Таблица 4 Общие линейные модели, объясняющие яйценоскость на одну курицу-несушку в контрольной группе и группе с добавлением Enterococcus faecalis UGRA10 в течение обеих половин экспериментального периода.

D.f. означает степени свободы. Значимые результаты выделены жирным шрифтом.

Куры-несушки на протяжении экспериментального периода производили значительно больше яиц размера L (от 63 до 73 г), независимо от лечения (GLM, количество яиц как зависимая переменная, Лечение как фактор, F1,47 = 0,04, P = 0,848, Размер яйца как фактор, F2,47 = 370,69, P < 0,001, Дата отбора как ковариата, F1,47 = 15,03, P < 0,001, Взаимодействие между размером яйца и лечением, F2,47 = 0,07, P = 0,931; Рисунок 6). Интересно, что ни одна курица не произвела яиц размера S (менее 53 г).

РИСУНОК 6 Среднее ± стандартная ошибка среднего количества яиц, произведенных курами-несушками. Один раз в неделю регистрировалось количество яиц, а также их вес и размер (m: средний; l: крупный; xl: экстра-крупный). Контрольные значения показаны красным, а значения кур-несушек, получавших добавку E. faecalis UGRA10 в рационе, показаны синим.

Добавление E. faecalis UGRA10 в рацион кур-несушек оказало положительное и значительное влияние на яйценоскость во второй половине эксперимента, позволив этим курам сохранять уровень продуктивности на протяжении всей продуктивной жизни. Эти благоприятные изменения продуктивности сопровождались значительными изменениями в микробиоте кишечника и увеличением присутствия E. faecalis UGRA10 на протяжении экспериментального периода в фекалиях. Эти результаты подтверждают использование E. faecalis UGRA10 как усилителя яйценоскости у кур-несушек при одновременной модификации разнообразия бактериального сообщества.

Поддержание уровня яйценоскости на протяжении всего срока службы кур-несушек является важнейшей задачей в птицеводстве, и использование пробиотиков является одной из наиболее перспективных стратегий для достижения этой цели (Patterson and Burkholder, 2003; Kabir, 2009). Наши результаты подтверждают эту стратегию, поскольку обработанные куры сохраняли яйценоскость, особенно во второй половине экспериментального периода, без изменения размера яиц. Фактически, яйца крупного размера (L: 63–73 г; и XL: >73 г) были наиболее производимыми. Эти результаты являются действительно многообещающими, поскольку яйца крупного размера наиболее востребованы на различных рынках (Araneda Uson, 2006; Souza, 2008; Bejaei, 2009; Reichmann Bellino and Arias Nieto, 2016; Zakowska-Biemans and Tekien, 2017). Изучались различные бактериальные штаммы, и их влияние тестировалось на продуктивность животных, яйценоскость, усиление иммунной системы и изменения в кишечном микробиоме. Например, Rhodobacter capsulatus улучшал здоровье кур и качество яиц в последний период яйцекладки (Lokhande et al., 2013); Bacillus subtilis был успешно протестирован против инфекции Salmonella (Oh et al., 2017) и повышал качество яиц и продуктивность (Ribeiro et al., 2014); а B. licheniformis действовал как усилитель иммунной системы и регулятор гормонов (Wang et al., 2017). Использование E. faecalis UGRA10 показало некоторые преимущества, поскольку энтерококки являются распространенными бактериями у теплокровных животных (Krieg and Holt, 1984) и обладают благоприятным взаимодействием с иммунной системой (Franz et al., 2011), гормонами и метаболизмом (Zhao et al., 2013) и кишечной микробиотой (Han et al., 2013; Park et al., 2016). Мы выделили высокую долю Enterococcus sp. во всех образцах фекалий, примерно на один логарифмический порядок меньше, чем общие анаэробные бактерии, поэтому этот таксон хорошо представлен в этих образцах фекалий. Интересно, что присутствие E. faecalis UGRA10 увеличивалось в течение экспериментального периода в обработанной группе, пока не стало доминирующим в образцах фекалий. Этот результат предполагает, что этот штамм может заменять другие штаммы/виды Enterococcus. Такое замещение между видами Enterococcus ранее описывалось (Sakai et al., 2006; Saelim et al., 2012) и может быть вызвано продукцией антагонистических веществ против близкородственных видов (Foulquie Moreno et al., 2003, 2006; Martín-Platero et al., 2006, 2009; Ruiz-Rodríguez et al., 2013). В этом смысле способность аллохтонных бактерий, таких как пробиотики, закрепляться и процветать в сложных бактериальных экосистемах (таких как кишечник позвоночных) низка и зависит от таксона (Thomas and Versalovic, 2010). Однако положительные эффекты этих транзиторных бактерий связаны с активным и временным взаимодействием с иммунной системой хозяина (Are et al., 2008; Thomas and Versalovic, 2010), даже если они не закрепляются как постоянные члены бактериального сообщества (Derrien and Vlieg, 2015). Например, Enterococcus как пробиотик в птицеводстве, по-видимому, индуцирует физические изменения в структуре кишечника, особенно в развитии отношения высоты ворсин к глубине крипт и высоты ворсин в подвздошной кишке (Awad et al., 2008), что приводит к повышению переваримости питательных веществ (Park et al., 2016). Альтернативная и не исключающая друг друга гипотеза указывает на роль энтерококков как стимуляторов иммунной системы (Franz et al., 2011) или гормональных медиаторов в продуктивности птицы (Zhao et al., 2013). Эти взаимодействия с иммунной системой были изучены на модельных организмах (Foligne et al., 2007; de Vrese and Schrezenmeir, 2008), хотя наши знания об этом взаимодействии у птицы все еще ограничены. У бройлеров добавление пробиотиков в рацион повышает уровни иммуноглобулинов в сыворотке/плазме крови и способствует изменению количества иммунных клеток и их фагоцитарной способности (Apata, 2008; Lee et al., 2011; Zhang et al., 2012; Salim et al., 2013; Ahmed et al., 2014; Beirao et al., 2018). Использование E. faecium в качестве пробиотика также приводит к увеличению титров антител против патогенов (Nayebpor et al., 2007), изменениям в метаболической эффективности печени (Zheng et al., 2016), модификациям протеома слизистой оболочки кишечника (Luo et al., 2013) или повышению уровня лептина и, следовательно, скорости роста (Arslan et al., 2004). У кур-несушек комбинация пробиотиков усиливала антительный ответ (Zhang et al., 2012). Однако механизмы, объясняющие взаимодействие между использованием Enterococcus в качестве пробиотика и иммунной системой и/или гормонами у кур-несушек, все еще остаются неясными, поэтому необходимы дальнейшие эксперименты для выяснения этих взаимосвязей.

Микробиом подвздошной кишки у бройлеров характеризуется доминированием Lactobacillus, за которым следуют виды Clostridium, Streptococcus и Enterococcus (Lu et al., 2003). Однако Clostridium sp. и близкородственные виды становились доминирующими в слепой кишке кур-несушек, за ними следовали представители типа Bacteroidetes, особенно Bacteroides, Butyricimonas и Prevotella (Callaway et al., 2009; Nordentoft et al., 2011). Наши результаты согласуются с этими предыдущими данными, особенно на уровне типов, хотя и различаются по значимости различных родов. Эти различия в бактериальном сообществе были обнаружены в основном в подвздошной кишке между лечебными группами и временем отбора. Обработанные куры содержали больше бактериальных видов и более широкий спектр филогенетического разнообразия в подвздошной кишке, чем контрольные. Тем не менее, бактериальное сообщество в слепой кишке показало сходные уровни альфа-разнообразия между лечебными группами. Эти результаты по альфа-разнообразию подтверждаются результатами по бета-разнообразию. Бактериальные сообщества тесно группировались при сравнении сходства в матрицах расстояний Unifrac, что свидетельствует об изменении микробиома в кишечнике обработанных кур.

Благоприятные эффекты антибиотиков у бройлеров и кур связаны с изменениями в микробном сообществе кишечника (Choi et al., 2018), особенно в сторону продуцентов короткоцепочечных жирных кислот (Banerjee et al., 2018), а также с увеличением метаболитов аминокислот, жирных кислот, нуклеозидов и витаминов (Gadde et al., 2018). Альтернативно, антибиотики улучшают продуктивность через противовоспалительный эффект, опосредованный кишечным эпителием (Niewold, 2007). Несмотря на различия в природе антибиотиков и пробиотиков, эффекты обоих агентов на животных, по-видимому, сходны. Enterococcus, используемый в качестве пробиотика в птицеводстве, индуцирует сдвиги в фекальной микробиоте (Han et al., 2013), особенно снижая популяции Salmonella (Waters et al., 2005), хотя численность основных типов (Bacteroidetes и Firmicutes) остается стабильной (Zhao et al., 2013). Рацион с добавлением E. faecalis UGRA10 вызывал изменения в бактериальном сообществе как в подвздошной, так и в слепой кишке и подтверждает, по крайней мере частично, гипотезу о том, что благоприятное влияние на поддержание яйценоскости может быть опосредовано воздействием на кишечный микробиом. Для выявления возможных механизмов, связанных со стимуляцией иммунной системы или взаимодействием с гормонами, необходимы дальнейшие эксперименты.

Данный эксперимент поддерживает использование E. faecalis UGRA10 в рационе кур-несушек для успешного поддержания уровня яйценоскости и изменения разнообразия микробиома — эффектов, сходных с теми, которые наблюдаются при использовании антибиотиков (Park et al., 2016). Однако использование бактериального штамма позволило бы избежать применения антибиотиков в птицеводстве, поскольку вместо высоких доз антибиотиков при длительном воздействии в сообщество вводится новый член бактериального сообщества.

Дополнительные материалы к этой статье можно найти онлайн по ссылке: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.01042/full#supplementary-material

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ РИСУНОК S1

Столбчатые диаграммы относительной численности бактерий на уровне классов у кур-несушек в разных отделах кишечника, временных точках отбора и лечебных группах. Классы в легенде отсортированы по относительной численности последовательностей — от наиболее обильных к наименее обильным. UGRA обозначает кур, получавших Enterococcus faecalis UGRA10 в концентрации 10⁸ колониеобразующих единиц на грамм корма; 40 и 80 обозначают количество дней после начала эксперимента.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ РИСУНОК S2

Столбчатые диаграммы относительной численности бактерий на уровне родов в подвздошной и слепой кишке кур-несушек в разных отделах кишечника (подвздошная и слепая кишка), временных точках отбора (30 и 80 дней) и лечебных группах (контроль и UGRA) (A) или сгруппированные по отделу кишечника, времени отбора и лечению (B). Классы в легенде отсортированы по относительной численности последовательностей. UGRA обозначает кур, получавших Enterococcus faecalis UGRA10 в концентрации 10⁸ колониеобразующих единиц на грамм корма; 40 и 80 обозначают количество дней после начала эксперимента.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ТАБЛИЦА S1

Объемы выборок бактериального сообщества подвздошной и слепой кишки кур-несушек, успешно амплифицированных на платформе Illumina MiSeq, в разные сроки отбора. В скобках указан объем выборки до амплификации.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ТАБЛИЦА S2

Количество яиц, произведенных курами, получавшими контрольные рационы и рационы с добавлением Enterococcus faecalis UGRA10 на протяжении экспериментального периода.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ТАБЛИЦА S3

Сводка средних (±SE) индексов альфа-разнообразия на основе бактериального сообщества подвздошной и слепой кишки кур-несушек, секвенированных на Illumina Miseq. Различные индексы разделены по отделу кишечника, дате отбора и лечению. В обработанной группе куры получали добавку Enterococcus faecalis UGRA10. Также указан объем выборки.

¹ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/

Peralta-Sánchez JM, Martín-Platero AM, Ariza-Romero JJ, Rabelo-Ruiz M, Zurita-González MJ, Baños A, Rodríguez-Ruano SM, Maqueda M, Valdivia E and Martínez-Bueno M (2019) Egg Production in Poultry Farming Is Improved by Probiotic Bacteria. Front. Microbiol. 10:1042. doi: 10.3389/fmicb.2019.01042

Перевод статьи «Egg Production in Poultry Farming Is Improved by Probiotic Bacteria» авторов Peralta-Sánchez JM, Martín-Platero AM, Ariza-Romero JJ, Rabelo-Ruiz M, Zurita-González MJ, Baños A, Rodríguez-Ruano SM, Maqueda M, Valdivia E and Martínez-Bueno M., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык

Фото: Designed by Freepik