Опубликовано 10 минут назад

Микробы в навозе и молоке зависят от типа фермы

Органическое земледелие всё чаще продвигается как средство снижения воздействия искусственных удобрений, пестицидов, гербицидов и антибиотиков на окружающую среду в традиционных молочных системах. Эти факторы потенциально влияют на микробные сообщества на разных этапах производства (почва, силос, навоз и молоко) в рамках всего фермерского цикла. Однако неизвестно, отражает ли микробиота, характерная для разных производственных этапов, различия в сельскохозяйственных методах — например, между органическим и традиционным ведением хозяйства. Кроме того, перенос микробных сообществ между производственными этапами изучен слабо.

Мы секвенировали микробные сообщества образцов почвы, силоса, навоза и молока, взятых на органических и традиционных молочных фермах в Нидерландах. Мы обнаружили, что структура сообществ почвенных грибов и бактерий значительно различалась в зависимости от типа почвы, но не между органическими и традиционными системами ведения хозяйства. Микробные сообщества силоса также не различались между традиционными и органическими системами. Тем не менее, микробиота навоза коров и грибные сообщества в молоке были значительно структурированы в зависимости от сельскохозяйственной практики. Мы делаем вывод, что, хотя производственные этапы на молочных фермах, по-видимому, не связаны между собой с точки зрения переноса микроорганизмов, некоторые практики, характерные для каждой системы ведения хозяйства, такие как состав рациона и применение антибиотиков, являются потенциальными драйверами сдвигов в микробиоте коров, включая производимое молоко. Это может отражать различия в здоровье сельскохозяйственных животных и качестве молочных продуктов в зависимости от методов ведения хозяйства.

Из-за интенсификации производства молочная промышленность сталкивается с такими проблемами, как качество воды, энергопотребление, выбросы парниковых газов, утрата биоразнообразия, устойчивость к антибиотикам и здоровье животных во всем мире (FAO, 2006; Janzen, 2011). Для улучшения агроэкологических систем и усиления процессов саморегуляции агроэкосистем на фермах все активнее продвигаются органическое земледелие и, в последнее время, природоориентированное или восстановительное сельское хозяйство (Gomiero и др., 2011; Erisman и др., 2016). В отличие от традиционного земледелия, органическое сельское хозяйство запрещает использование искусственных удобрений, пестицидов и гербицидов и ограничивает применение антибиотиков. Кроме того, рацион коров на органических фермах содержит меньше концентратов и кукурузного силоса (Sundrum, 2001). Из-за различий в управлении между этими двумя сельскохозяйственными системами коровы с органических и традиционных ферм подвергаются воздействию различных условий окружающей среды, что потенциально влияет на состав их микробиоты.

Несмотря на отсутствие широко признанного консенсуса относительно того, как измерять устойчивость таких сельскохозяйственных систем, предполагается, что органическое земледелие является более устойчивым, чем традиционное, хотя требуются более углубленные исследования (Fess и Benedito, 2018). В производственном цикле молочной фермы каждый этап производства может влиять на микробный состав последующего этапа (Doyle и др., 2017). Следовательно, вовлеченность и потенциальный перенос микробных сообществ через производственные этапы является ключевым для понимания источников микроорганизмов и, соответственно, их последующих воздействий. Следует рассматривать несколько производственных этапов. Во-первых, это почвы, на которых выращивается корм для молочного скота. Предыдущие исследования показали, что почвы при органических и традиционных методах обработки содержат различные микробные сообщества (Hartmann и др., 2015), что свидетельствует о положительном влиянии органического земледелия на микробное разнообразие и состав почвы (Lupatini и др., 2017). Микробное разнообразие почвы и общее состояние почвы напрямую влияют на продуктивность и состав кормов (Van Der Heijden и др., 2008). Травяной силос, которым кормят коров в зимние месяцы, обычно содержит большое количество молочнокислых бактерий, что обусловлено селективностью процесса ферментации (McDonald, 1981), разнообразие которых зависит от субстрата и происхождения (Pang и др., 2011). Субстрат и происхождение будут зависеть от состава корма, из которого производится силос, удобрения, процедур уборки урожая, загрязнения почвой и использования силосных добавок. Следовательно, в зависимости от происхождения силоса (органический или традиционный) его микробиота, вероятно, оказывает различное влияние на микробиоту сельскохозяйственных животных, такую как их навоз и, в конечном счете, молоко как конечный продукт.

Внутренний состав микробиоты млекопитающих, таких как коровы, часто связан с их общим состоянием здоровья. Например, было показано, что кишечная микробиота способна модулировать иммунную систему, развитие и физиологию хозяина (Sommer и Bäckhed, 2013). Для коров важными направлениями исследований были влияние различных рационов на бактериальный состав кишечника (De Menezes и др., 2011; Thoetkiattikul и др., 2013; Faulkner и др., 2017) и характеристика микробиоты в связи с возникновением некоторых заболеваний, таких как мастит (Zhang и др., 2015; Derakhshani и др., 2018; Ma и др., 2018). Рацион особенно важен для формирования микробиоты молочных коров, поскольку животные находятся под давлением необходимости производства большого количества молока, что требует высокой энергетической и питательной нагрузки (Sundrum, 2001). В интенсивных системах молочного производства животные получают высокую долю зерновых и сопутствующих продуктов переработки в виде концентратов в рационе, что, как сообщается, сильно влияет на состав желудочно-кишечной микробиоты (Dias и Ametaj, 2017). Эти различия в желудочно-кишечной микробиоте потенциально могут отражать изменения в микробном составе молока (Verdier-Metz и др., 2009). Также предполагается, что состав рациона влияет на производство и состав молока (Tong и др., 2018) и ассоциированную с ним микробиоту (Zhang и др., 2015). Кроме того, микробиота в молоке может зависеть от окружающей среды молочной фермы (Zhang и др., 2015) из-за местных потенциальных источников загрязнения, таких как поверхность сосков или доильное оборудование (Verdier-Metz и др., 2009; Doyle и др., 2017).

В предыдущих исследованиях микробные сообщества, в основном бактерий, оценивались для отдельных производственных этапов молочной фермы без одновременного анализа всего фермерского цикла. Таким образом, такие исследования не дают ответа на вопрос о том, как различные методы управления влияют на микробиоту фермы через перенос микробных сообществ через производственные этапы. В данном исследовании мы ставим целью сравнить микробиоту (грибы и бактерии) молочных ферм при органических и традиционных методах управления на песчаных и торфяных почвах, проверяя общую гипотезу о том, что фермерские среды – органические и традиционные – влияют на весь производственный цикл молочной фермы: от почвы, местного силоса, желудочно-кишечной микробиоты коров, отражаемой в навозе, и вплоть до молока. Такие потенциальные воздействия – наблюдаемые в микробиоте коров – могут служить индикаторами здоровья коров или в конечном счете отражать особые свойства качества и продуктивности молока. Таким образом, понимание того, влияют ли методы ведения хозяйства при органических и традиционных сельскохозяйственных системах на микробиоту коров и каким образом, необходимо для определения устойчивых стратегий управления молочными фермами.

Описание участков и отбор проб

Было отобрано десять пар органических и традиционных молочных ферм в Нидерландах, из которых пять пар располагались на песчаных почвах, а другие пять пар – на торфяных почвах. Пары органических и традиционных ферм были соседними фермами на расстоянии не более 500 м на одном типе почвы. Чтобы дополнительно избежать смешивающих факторов и позволить рассматривать фермы как повторности в нашем анализе, мы обеспечили, чтобы на каждой ферме было около 70 лактирующих коров и чтобы коровники всех органических и традиционных ферм были оборудованы стойлами с боксами для коров и щелевыми полами. Отбор проб в этом исследовании соответствовал методам управления, принятым на молочной ферме (органическим или традиционным), и не оказывал активного воздействия на животных.

На каждой ферме отбирались пробы почвы на пастбище вблизи фермы, травяного силоса, которым кормили молочных коров в день отбора проб, свежего навоза, собранного непосредственно от коров, и молока из общего резервуара. Измерения в фекалиях, которые собирались при спонтанной дефекации пяти случайных коров, и молоко из общего резервуара также не являлись инвазивными для животных. Отбор проб проводился в течение одной недели с 7 по 13 марта 2018 года, когда коров содержали исключительно в помещении в зимний период, чтобы исключить различия в выпасе между фермами. Протокол отбора проб различался для каждого производственного этапа. Предварительная обработка проб, взятых с разных производственных этапов, проводилась ежедневно сразу после сбора образцов.

Из почвы отбирались пять кернов (диаметр 2,3 см) на глубину 0–10 см на пастбище рядом с фермой и объединялись в составной образец (обзор свойств почвы приведен в дополнительных методах S1). Травяной силос отбирался буром (диаметр 3,0 см и длина 100 см) из центра силосной ямы, откуда коров кормили в момент отбора проб (обзор рациона и свойств силоса приведен в дополнительных методах S2, S3). Для выделения ДНК силос измельчали стерильной ступкой и пестиком с жидким азотом, и 250 мг измельченного силоса переносили в лизирующий раствор из набора NucleoMag 96 Plant Kit. Образец навоза получали путем объединения эквивалентных количеств фекалий, собранных при спонтанной дефекации пяти случайных коров, которые затем гомогенизировали перемешиванием. Аликвоту 250 мг переносили в лизирующий раствор из пробирок с микрогранулами Powersoil. Наконец, молоко отбирали из общего резервуара, чтобы оно представляло все стадо каждой фермы (обзор свойств молока приведен в дополнительных методах S4). Образцы молока для выделения ДНК собирали в две стерильные пробирки Falcon объемом 50 мл и центрифугировали при 5 400 × g в течение 30 мин при 4°C. Жировой слой аккуратно удаляли, а супернатант декантировали. Полученные осадки дважды промывали стерильным PBS и центрифугировали при 14 000 × g в течение 1 мин, а затем объединяли. Приблизительно 250 мг осадка растворяли в лизирующем растворе из пробирок с микрогранулами Powersoil. Предварительно обработанные образцы в лизирующем растворе из набора для экстракции хранили при –20°C до завершения отбора проб и обрабатывали сразу после. Все оборудование для отбора проб почвы, силоса, навоза и молока стерилизовали на поверхности 90% этанолом между сборами.

Выделение ДНК и секвенирование

ДНК выделяли из почвы, навоза и молока с использованием набора DNeasy Powersoil Kit (Qiagen, Венло, Нидерланды), а из силоса – с использованием набора NucleoMag 96 Plant Kit (Macherey-Nagel Gmbh & Co., Дюрен, Германия), следуя протоколам производителя. Для получения грибных сообществ амплифицировали регион ITS2 с использованием праймеров fITS7/ITS4 (White и др., 1990; Ihrmark и др., 2012), содержащих адаптерный участок Illumina, а для получения бактериальных сообществ амплифицировали фрагмент V4 региона гена 16S рРНК с использованием стандартных методов, разработанных Earth Microbiome Project, с праймерами 515F/806R (Caporaso и др., 2010), содержащими адаптерный участок Illumina. Продукты ПЦР очищали с использованием 0,9 × NucleoMag NGS Clean-Up и Size Selectbeads (Macherey-Nagel, Дюрен, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Адаптеры Illumina Nextera XT добавляли к ампликонам с помощью второй ПЦР объемом 20 мкл, содержащей 8 циклов (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США). Концентрацию этих индивидуальных индексированных ампликонов измеряли с помощью QIAxcel с использованием набора DNA Screening Kit (Qiagen, Венло), нормализовали и объединяли в эквимолярных количествах для грибов и бактерий в отдельные библиотеки с использованием робота QIAgility (Qiagen, Венло). Два пула подвергали окончательной очистке с использованием 0,9 × NucleoMag NGS Clean-Up и Size Selectbeads (Macherey-Nagel, Дюрен, Германия). Качество и количество этих двух пулов проверяли на Bioanalyzer с использованием высокочувствительного чипа (Agilent). Секвенирование проводилось в двух запусках на платформе Illumina MiSeq с использованием набора для парноконцевого чтения длиной 300 п.н. (BaseClear, Нидерланды).

Анализ микробных сообществ

Сырые последовательности как грибов, так и бактерий объединяли в пары на основе минимального перекрытия в 30 нуклеотидов, и праймеры удаляли. Затем последовательности фильтровали, отбрасывая последовательности с ожидаемой ошибкой >1. Отфильтрованные по качеству последовательности денисилировали с использованием алгоритма UNOISE3 (Nearing и др., 2018) для создания операционных таксономических единиц с нулевым радиусом (Zotus). Zotus представляют собой точные варианты последовательностей, которые обеспечивают более высокое разрешение при определении таксонов, чем традиционные методы кластеризации, где кластеры последовательностей определяются на основе фиксированного порога сходства (Callahan и др., 2017). Предполагаемые химеры удаляли. Все вышеуказанные шаги выполнялись с использованием USEARCH v.11 (Edgar, 2010). Чтобы удалить ложные показания, обусловленные перекрестным сигналом (присвоение прочтений неверному образцу), мы удалили все Zotus, представленные <0,02% прочтений в каждом образце, что является даже более консервативным подходом, чем предыдущие оценки ошибок (Bokulich и др., 2013). В анализе использовались как данные об относительной численности, так и данные о присутствии–отсутствии микробных Zotus. Сырые последовательности депонированы в Short Read Archive NCBI под номером проекта PRJNA627834.

Грибным Zotus присваивали таксономические группы с использованием алгоритма Blast на основе поиска попарного сходства по базе данных последовательностей грибного ITS UNITE+INSD (версия 7.2, выпущена 10 октября 2017 г.), которая содержит присвоения OTU на уровне видов для репрезентативных последовательностей грибов (Kõljalg и др., 2013). Zotus сохранялись, если они имели >80% сходства и >150 п.н. длины попарного выравнивания с грибной Species Hypothesis из грибной базы данных. Бактериальным Zotus присваивали таксономические группы путем поиска по базе данных SILVA (Quast и др., 2013), содержащей выверенные последовательности 16S бактерий.

Анализ разнообразия микробных сообществ

Количество прочтений сильно варьировало в пределах наборов данных отдельных производственных этапов. Таким образом, для изучения общих закономерностей микробного разнообразия между производственными этапами (почва, силос, навоз и молоко) таблицы Zotus были ресемплированы до глубины 2 500 для грибов и 1 000 для бактерий (кривые разрежения представлены на дополнительном рисунке S1). Для тех образцов, которые давали меньшее количество прочтений, чем выбранная глубина, мы проводили последующий анализ дважды, включая и исключая эти образцы. Значимость результатов оставалась неизменной; таким образом, для полноты мы представляем результаты для всего набора данных. Образцы с <200 прочтений были удалены, в результате чего в наборе данных грибов были удалены один образец почвы, один образец силоса и один образец молока, а в наборе данных бактерий – один образец почвы, один образец молока и два образца навоза.

Филогенетическая видовая изменчивость (PSV) рассчитывалась как мера альфа-разнообразия с использованием пакета picante R (Kembel и др., 2010). Эта мера статистически независима от видового богатства, поэтому она менее смещена, чем филогенетическое разнообразие Faith. PSV стремится к единице, когда сообщества в одном образце не связаны между собой, и стремится к нулю по мере того, как таксоны в сообществе становятся более родственными (Kembel и др., 2010). Филогенетические взаимосвязи между Zotus рассчитывались на основе выравнивания грибных ITS и бактериальных 16S, выполненного с помощью MAFFT v. 7.388 (Katoh и Standley, 2013), и построения дерева с использованием RaxML v. 8.2.12 с моделью GTRCAT (Stamatakis, 2014). Филогении были преобразованы в ультраметрические деревья с использованием PATHd8 (Britton и др., 2007). Попарное расстояние между таксонами вычислялось с использованием cophenetic.phylo в пакете ape R (Paradis и Schliep, 2019). Различия в PSV в зависимости от производственного этапа и сельскохозяйственной системы в пределах производственных этапов оценивались с использованием теста Крускала–Уоллиса в сочетании с тестом Данна в качестве пост-хок теста с поправками Бенджамини–Хохберга для множественных сравнений, с использованием пакета dunn.test R (Dinno, 2017).

Влияние сельскохозяйственной системы

Для отображения различий в составе сообществ между сельскохозяйственными системами и типами почв было выполнено неметрическое многомерное шкалирование (NMDS) с использованием расстояний Брея–Кёртиса с применением пакета vegan R (Oksanen и др., 2015). Для визуализации относительной численности основных семейств грибов и бактерий в пределах производственных этапов были построены графики таксонов.

Влияние сельскохозяйственной системы (органическая и традиционная) и типов почв (песок и торф) на состав микробных сообществ оценивалось с помощью модельно-ориентированного подхода к анализу многомерных данных (Warton и др., 2015) с использованием функции ManyGlm, входящей в пакет mvabund R (Wang и др., 2012). Наши данные демонстрировали сильную зависимость среднего от дисперсии (не показано), для которой модельно-ориентированные подходы работают лучше, чем подходы, основанные на расстояниях (Wang и др., 2012). Мы использовали ManyGlm с отрицательным биномиальным распределением для данных об относительной численности и с биномиальным распределением для данных о присутствии–отсутствии. С помощью ManyGlm для каждого таксона подбирается модель, и отношение правдоподобия (LR) каждой модели суммируется для создания общего показателя суммы LR, который может использоваться как тестовая статистика посредством рандомизации. Структура модели была одинаковой для всех четырех производственных этапов (почва, силос, навоз и молоко) и включала сельскохозяйственную систему, вложенную в пару, и тип почвы в качестве фиксированных категориальных факторов, с включением взаимодействия между сельскохозяйственной системой и типом почвы. Состав грибов и бактерий анализировался отдельно. Изучение графиков остатков из ManyGlm не выявило четких закономерностей, указывающих на то, что модели были адекватными. Значимость моделей рассчитывалась с использованием 999 итераций ресемплинга с помощью метода PIT-trap ресемплинга (Warton и др., 2017). Чтобы определить, какие таксоны вносят наибольший вклад в сдвиги в составе сообществ, рассчитывался индивидуальный вклад каждого Zotu в общую сумму LR, а P-значения корректировались с поправками Бенджамини–Хохберга для множественного тестирования. Кроме того, мы применили линейный дискриминантный анализ (LDA) в сочетании с измерениями размера эффекта (LEfSe), который выполняет непараметрический критерий Уилкоксона с ранговой суммой, за которым следует LDA-анализ (Segata и др., 2011), для оценки таксономических групп с дифференциальной численностью (на более высоких таксономических уровнях, чем отдельные Zotus), которые наиболее вероятно объясняют различия между сельскохозяйственными системами (включенными в анализ как классы), и последующего использования набора попарных тестов между двумя типами почв (включенными в анализ как подклассы). Для дальнейшего исследования потенциальной связи между составом рациона и микробиотой коров (навоз и молоко), а также между свойствами молока, включая молочную продуктивность, и его микробными сообществами, мы выполнили несколько моделей ManyGlm для каждой матрицы грибных и бактериальных сообществ (см. дополнительные методы S5).

Таксономическое присвоение

Грибы

В общей сложности 1 727 грибных Zotus были представлены 2 974 303 прочтениями, прошедшими фильтрацию по качеству, со средним значением 38 688 и стандартным отклонением 17 340 прочтений на образец. Ascomycota (86,28% всех прочтений почвы, 84,52% всех прочтений силоса, 91,68% всех прочтений навоза и 72,13% всех прочтений молока) и Basidiomycota (10,59% всех прочтений почвы, 15,01% всех прочтений силоса, 7,28% всех прочтений навоза и 18,89% всех прочтений молока) были наиболее доминирующими типами на всех производственных этапах. Только один Zotu, принадлежащий к семейству Aspergillaceae, был общим для всех образцов навоза на всех фермах, и ни один не был общим для всех образцов молока. Основными грибными семействами, присутствующими в образцах навоза, были Aspergillaceae (24%), Ascosphaeraceae (8,13%) и Saccharomycetaceae (6,20%); а в образцах молока – Aspergillaceae (5,74%), Cyphellophoraceae (4,86%), Hypocreaceae (2,90%), Microascaceae (2,62%) и Pyronemataceae (2,21%).

Филогенетическая видовая изменчивость PSV различалась между четырьмя производственными этапами (хи-квадрат = 26,98, df = 3, P < 0,01). Почва (n = 19) имела значительно менее разнообразные грибные сообщества по сравнению с силосом (n = 19), навозом (n = 20) и молоком (n = 19). Производственные этапы не различались значимо между собой с точки зрения филогенетического разнообразия (рисунок 1 и дополнительная таблица S4). Филогенетическое разнообразие грибных сообществ не различалось между сельскохозяйственными системами или типами почв ни для одного производственного этапа (таблица 1).

РИСУНОК 1 Филогенетическое разнообразие грибов и бактерий на четырех производственных этапах – почва, силос, навоз и молоко – измеренное с помощью филогенетической видовой изменчивости (PSV). Линия, разделяющая коробчатые диаграммы, представляет медианное значение.

ТАБЛИЦА 1 Статистические результаты теста Крускала–Уоллиса, сравнивающего филогенетическую видовую изменчивость (PSV) типов образцов между двумя типами почв, песок и торф, и двумя сельскохозяйственными системами, традиционная и органическая.

Бактерии

В общей сложности 1 446 бактериальных Zotus были представлены 241 425 прочтениями, прошедшими фильтрацию по качеству, со средним значением 3 177 и стандартным отклонением 2 743 прочтений на образец. Firmicutes (6,25% всех прочтений почвы, 57,23% всех прочтений силоса, 71,65% всех прочтений навоза и 37,90% всех прочтений молока), Actinobacteria (28,88% всех прочтений почвы, 8,27% всех прочтений силоса, 2,59% всех прочтений навоза и 38,85% всех прочтений молока), Proteobacteria (14,44% всех прочтений почвы, 34,25% всех прочтений силоса, 1,14% всех прочтений навоза и 21,34% всех прочтений молока) и Chloroflexi (18,25% всех прочтений почвы, 0,11% всех прочтений силоса и 0,14% всех прочтений молока) были четырьмя доминирующими типами на всех производственных этапах. Индивидуальные Zotus, общие для всех образцов навоза на всех фермах, включали Bacteroidales, Christensenellaceae, Lachnospiraceae, Rikenellaceae, Ruminococcaceae, Akkermansia, Paeniclostridium и Roseburia, представляя 79,07% всех прочтений навоза. Только один Zotu, принадлежащий к семейству Corynebacteriaceae, присутствовал во всех образцах молока на всех фермах.

PSV значимо различалась между производственными этапами (хи-квадрат = 67,89, df = 3, P < 0,01). Почва (n = 19) имела наиболее значимо разнообразные бактериальные сообщества, за ней следовали силос (n = 20), молоко (n = 19) и навоз (n = 18) (рисунок 1 и дополнительная таблица S4). Филогенетическое разнообразие бактериальных сообществ в навозе значимо различалось между органическими и традиционными фермами, в то время как филогенетическое разнообразие бактериальных сообществ в почве значимо различалось между песчаными и торфяными почвами (таблица 1). Несмотря на то, что только разнообразие бактерий в навозе, измеренное с помощью PSV, было значительно выше на органических фермах по сравнению с традиционными (таблица 1 и рисунок 1), мы заметили, что в целом PSV для бактерий на органических фермах обычно выше, чем на традиционных.

Однако для грибов наблюдалась противоположная тенденция: грибное разнообразие было выше на традиционных фермах, чем на органических (таблица 1 и рисунок 1).

Сравнение микробного разнообразия на четырех производственных этапах

Состав грибов и бактерий структурировался по производственному этапу как для данных об относительной численности (грибы: ManyGlm отклонение = 12 341, df = 73, P = 0,001; бактерии: отклонение = 30 712, df = 72, P = 0,001), так и для данных о присутствии–отсутствии (грибы: ManyGlm отклонение = 12 332, df = 73, P = 0,001; бактерии: отклонение = 28 847, df = 72, P = 0,001). Следовательно, каждый производственный этап (почва, силос, навоз и молоко) характеризовался различными составами микробных сообществ (рисунок 2) и относительной численностью основных специфических семейств грибов и бактерий (рисунок 3 и дополнительные таблицы S5, S6). Грибные сообщества силоса, навоза и молока были более схожи между собой, чем с почвой, в то время как бактериальные сообщества навоза и молока были более схожи по сравнению с сообществами силоса и почвы (рисунок 2).

РИСУНОК 2 Разнообразие грибов и бактерий на четырех производственных этапах, оцененное на основе наборов данных об относительной численности и присутствии–отсутствии. Символы синего и коричневого цвета обозначают органические и традиционные фермы соответственно.

РИСУНОК 3 Относительная численность каждого семейства грибов (A) и бактерий (B), присутствующего на каждом производственном этапе, в зависимости от сельскохозяйственной системы. Глубина выборки была установлена на уровне 1500 для грибов и 1000 для бактерий. Zotus, которые не удалось идентифицировать ниже уровня порядка, обобщены как "неклассифицированные". Все семейства, представленные менее чем 5% от общего числа прочтений, обобщены в "Остальные".

Влияние сельскохозяйственных систем на микробные сообщества и их потенциальные драйверы в пределах производственных этапов

Почва

Как с точки зрения присутствия–отсутствия, так и относительной численности, грибные и бактериальные сообщества не структурировались по сельскохозяйственной системе, в то время как только для данных о присутствии–отсутствии как грибы, так и бактерии значимо структурировались по типу почвы (таблицы 2, 3 и рисунок 4A). Однако анализ LEfSe показал, что бактерии в почве, такие как Dactylosporangium, Micromonospora и Chloroflexia, были статистически ассоциированы с органическими фермами, в то время как порядок Tepidisphaerales был ассоциирован с традиционными фермами (дополнительный рисунок S2). Анализ относительной численности почвенных грибов выявил значимое взаимодействие между сельскохозяйственной системой и типом почвы (дополнительные таблицы S7, S8 и дополнительный рисунок S3A).

РИСУНОК 4 Структура грибных и бактериальных сообществ в почве (A), силосе (B), навозе (C) и молоке (D), окрашенная в зависимости от сельскохозяйственной системы. Грибы представлены пустыми символами, бактерии – полными. Параллельные рисунки на основе набора данных об относительной численности на уровне Zotu представлены на дополнительном рисунке S2.

ТАБЛИЦА 2 Таблица анализа отклонений для состава грибных сообществ на основе набора данных о присутствии–отсутствии в пределах четырех производственных этапов (почва, силос, навоз и молоко) в зависимости от сельскохозяйственной системы (традиционная и органическая) и типа почвы (песок и торф).

Статистика многомерного теста: отношение правдоподобия с 999 итерациями ресемплинга с помощью метода PIT-trap. Значимые результаты (P-значение < 0,05) выделены жирным шрифтом.

ТАБЛИЦА 3 Таблица анализа отклонений для состава бактериальных сообществ на основе набора данных о присутствии–отсутствии в пределах четырех производственных этапов (почва, силос, навоз, молоко) в зависимости от сельскохозяйственной системы (традиционная и органическая) и типа почвы (песок и торф).

Силос

Данные о присутствии–отсутствии свидетельствуют о том, что грибные и бактериальные сообщества не структурировались по сельскохозяйственной системе или типу почвы (таблицы 2, 3 и рисунок 4B), в то время как данные об относительной численности показывают, что грибные сообщества значимо зависели от типа почвы, а бактериальные сообщества – от взаимодействия между сельскохозяйственной системой и типом почвы (дополнительные таблицы S7, S8 и дополнительный рисунок S3B). Анализ LEfSe показал, что грибной порядок Hypocreales был статистически ассоциирован с образцами силоса с органических ферм (дополнительный рисунок S2).

Навоз

Как грибные, так и бактериальные сообщества структурировались по сельскохозяйственной системе, с взаимодействием между сельскохозяйственной системой и типом почвы для бактерий при анализе присутствия–отсутствия (таблицы 2, 3 и рисунок 4C). Согласно анализу LEfSe, только бактерии, такие как Succinivibrio, Prevotella, Aeromodales, были статистически ассоциированы с образцами навоза на традиционных фермах (дополнительный рисунок S2). Анализ относительной численности показал, что грибные сообщества значимо структурировались в зависимости от сельскохозяйственной системы и типа почвы, включая взаимодействие между двумя переменными, в то время как бактериальные сообщества значимо различались только между сельскохозяйственными системами (дополнительные таблицы S7, S8 и дополнительный рисунок S3D). Грибные сообщества были значимо ассоциированы с долей травяного силоса в рационе и применением антибиотиков (дополнительная таблица S9).

Молоко

Анализ присутствия–отсутствия показал, что состав грибов и бактерий не зависел от сельскохозяйственной системы или типа почвы (таблицы 2, 3 и рисунок 4D). Однако с точки зрения присутствия–отсутствия грибные сообщества были значимо ассоциированы с составом рациона (например, количеством концентратов и долей травяного силоса) (дополнительная таблица S9), с применением антибиотиков, а также с молочной продуктивностью, содержанием жира и мочевины в молоке, в то время как бактериальные сообщества были ассоциированы с содержанием мочевины и жира в молоке (дополнительная таблица S10). С точки зрения относительной численности, грибные сообщества значимо структурировались по сельскохозяйственной системе, а также по типу почвы, включая взаимодействие между двумя переменными. Анализ LEfSe показал значимую ассоциацию грибов Dothideomycetes, Tremellomycetes и Pleosporales с образцами молока с органических ферм (дополнительный рисунок S2). Кроме того, грибные сообщества были значимо ассоциированы с применением антибиотиков, количеством концентратов в рационе (дополнительная таблица S9), а также с молочной продуктивностью (дополнительная таблица S10). Бактериальные сообщества не различались значимо между сельскохозяйственными системами или типами почв (дополнительные таблицы S7, S8 и дополнительный рисунок S3C), но образцы молока на традиционных фермах были статистически ассоциированы с семейством Rhodobacteraceae (дополнительный рисунок S2).

Мы не обнаружили статистической ассоциации между каким-либо грибным или бактериальным Zotu любого производственного этапа и сельскохозяйственными системами.

Мы проверили гипотезу о том, что фермерские среды и типы почв при органических и традиционных методах управления влияют на микробиоту на различных этапах производственного цикла фермы, включая почву, местный силос, желудочно-кишечную микробиоту коров, отражаемую в навозе, и молоко. Наши результаты показывают, что методы управления, ассоциированные с двумя сельскохозяйственными системами, не оказали значительного влияния на микробиоту почвы и силоса. Однако микробиота навоза и молока коров различалась между органическими и традиционными системами, что свидетельствует о разобщенности анализируемых этапов фермерского производственного цикла с точки зрения переноса микроорганизмов, но все же о наличии ассоциации с сельскохозяйственной системой. Различия, отмеченные в микробиоте коров в зависимости от методов ведения хозяйства, согласуются с недавними исследованиями, показывающими, что общая среда может оказывать большее влияние на формирование микробиоты индивидуумов, чем генетика (Rothschild и др., 2018). Кроме того, внутренние различия в составе рациона и применении антибиотиков между органическими и традиционными системами могут играть важную роль в формировании микробиоты коров, как предполагалось в предыдущих исследованиях (Hagey и др., 2019).

Разнообразие грибов и бактерий на всех производственных этапах – почва, силос, навоз и молоко – зависело от сельскохозяйственной системы и типа почвы, но по-разному. Каждый производственный этап демонстрировал особые таксономические группы грибов и бактерий, однако ни один Zotu не был значимо ассоциирован с какой-либо сельскохозяйственной системой. В целом, наиболее распространенные таксоны на производственных этапах присутствовали в образцах как органических, так и традиционных фермерских систем. Вероятно, это представители "ключевых" функциональных групп, принадлежащих к "ключевому" микробиому каждого производственного этапа (Turnbaugh и др., 2009). Таким образом, наблюдаемые эффекты, обусловленные влиянием метода ведения хозяйства и типа почвы, вероятно, происходили с таксонами, встречающимися в меньшей численности.

Грибные и бактериальные сообщества в почве структурировались по типу почвы – но не по сельскохозяйственной системе – что согласуется с выводами Fierer и Jackson (2006) и Fierer (2017), которые показали, что эдафические свойства, присущие определенным типам почв, являются основными драйверами микробного состава почвы. Предыдущие исследования выявили различия между органической и традиционной практиками, а именно, что добавление только органических удобрений вместо добавления искусственных удобрений приводило к существенным различиям в микробном составе, в основном в пахотных почвах, как грибов (Lalande и др., 2005; Ghimire и др., 2014), так и бактерий (Mas-Carrió и др., 2018), но что влияние пастбищ доминирует над влиянием системы (Rutgers и др., 2008; Deru и др., 2018). Процесс ферментации, которому подвергается силос и который селективно отбирает молочнокислые бактерии (McDonald, 1981), вероятно, определял его микробный состав, что наблюдалось по высокой относительной численности Lactobacillaceae. Этот эффект, по-видимому, сильнее, чем различия в методах управления или происхождении субстрата между органическими и традиционными фермами.

Предыдущие исследования показали, что рацион оказывает прямое влияние на микробиоту крупного рогатого скота (Zhang и др., 2015; Loor и др., 2016; Hagey и др., 2019). Соответственно, мы ожидали обнаружить прямое влияние микробных сообществ силоса из каждой сельскохозяйственной системы на микробиоту коров. Мы не обнаружили различий в составе микробных сообществ силоса, произведенного на органических или традиционных фермах и скормленного коровам в зимние месяцы. Однако, что удивительно, мы обнаружили, что микробиота навоза коров, включая состав как грибов, так и бактерий, значимо различалась между животными при органическом и традиционном управлении. Разнообразие бактерий было значительно выше у коров с органических ферм, что согласуется с предыдущими исследованиями, которые показали, что рационы, богатые концентратами, и применение антибиотиков – характерные практики на традиционных фермах – оказывают негативное влияние на разнообразие бактерий (Thomas и др., 2017; Zhang и др., 2017). В отличие от навоза, в молоке только изменения в относительной численности грибных сообществ, по-видимому, были связаны с сельскохозяйственной системой, но не их состав сообщества, и ни одно из них не было связано с бактериями. Таким образом, в нашем исследовании микробиота коров не была связана с микробным составом силоса при органических и традиционных методах управления. Вместо этого состав грибного сообщества как в навозе, так и в молоке был связан с долей травяного силоса в рационе и применением антибиотиков. Кроме того, количество концентратов в рационе влияло на грибы в навозе. Более высокая относительная доля кукурузного силоса и количество концентратов в рационе коров при традиционном земледелии, а также более частое применение антибиотиков часто составляют основное различие между традиционными и органическими фермерскими системами (Dias и Ametaj, 2017). В этом исследовании мы зафиксировали увеличение Prevotella в навозе коров с традиционных ферм. Эти бактерии очень часто встречаются в рубце и характерны для рубца животных с рационом, богатым зерновыми (Tajima и др., 2001). Кроме того, на традиционных фермах мы зафиксировали увеличение таких бактерий, как Succinivibrio. Это может указывать на то, что коровы на традиционных фермах имеют более низкий остаточный потребляемый корм (Hernandez-Sanabria и др., 2012) или более эффективное пищеварение, чем на органических фермах (VandeHaar и др., 2016). Что касается грибов, неожиданно мы обнаружили, что только 0,05% прочтений грибов в навозе принадлежат к Neocallimastigaceae – семейству, содержащему анаэробные грибы, часто встречающиеся в пищеварительном тракте травоядных. Ни один таксон не был значимо ассоциирован ни с одним из методов управления, что свидетельствует о том, что различия в рационе оказывают меньшее влияние на грибы по сравнению с бактериями, как также сообщалось ранее (Zhang и др., 2017). Кроме того, было показано, что применение антибиотиков подавляет определенные бактерии в кишечнике и, соответственно, в навозе жвачных животных (Holman и др., 2019). Таким образом, наше исследование подчеркивает, что наблюдаемые различия в микробиоте навоза и молока коров на органических и традиционных фермах не являются результатом переноса микробиоты, присутствующей в рационе, но связаны с содержанием рациона и применением антибиотиков в практике управления каждой фермой. Будущие исследования должны изучить наличие генов устойчивости к противомикробным препаратам в микробиоте коров в связи с применением антибиотиков на молочных фермах (Thomas и др., 2017).

Ассоциация Dothideomycetes, включая Pleosporales, и Tremellomycetes с молоком с органических ферм является неожиданной и неизвестной, поскольку грибы, относящиеся к этим классам, часто включают фитопатогены, растущие на древесных остатках или разлагающихся листьях, однако их присутствие отмечалось в среде молочных ферм (Mbareche и др., 2018) и на стеллажах, используемых для созревания сыра (Guzzon и др., 2017). Было описано, что микробиота воздушной пыли и условия содержания, такие как подстилка, влияют на состав микробиоты молока, поскольку соски коров непосредственно контактируют с подстилочным материалом, когда коровы отдыхают (Nguyen и др., 2019; Wu и др., 2019), а микробиота сосков является известным источником загрязнения микробиоты молока (Verdier-Metz и др., 2009; Doyle и др., 2017). Возможно, описанные в этом исследовании грибы чаще встречаются в среде органических ферм на определенных субстратах, но необходимы дальнейшие исследования для выявления источника этих грибов и оценки их значения в контексте молочных ферм. Общий состав грибов и бактерий показал значимую ассоциацию с составом рациона, а именно с количеством концентратов и долей травяного силоса, а также с применением антибиотиков. Интересно, что микробный состав также варьировал в зависимости от содержания мочевины и жира в молоке, а также молочной продуктивности. Было показано, что свойства молока косвенно формируют микробное сообщество молока (Williams и др., 2017; Moossavi и др., 2019). Таким образом, наши результаты указывают на то, что свойства молока различаются между органическими и традиционными фермами как с точки зрения питательных свойств, так и с точки зрения микробного состава.

В заключение, наше исследование изучило потенциал переноса микроорганизмов через различные производственные этапы на молочных фермах, охватывающих органические и традиционные методы ведения хозяйства. Наши результаты демонстрируют, что микробиота коров, отражаемая в навозе и молоке, зависит от системы управления хозяйством, несмотря на то, что в микробных сообществах почвы и силоса различий не обнаружено. Эти влияния систем управления хозяйством, по-видимому, связаны в первую очередь с количеством концентратов и долей травяного силоса в рационе, а также с применением антибиотиков. Учитывая, что содержание жира и мочевины в молоке и молочная продуктивность ассоциированы с микробными (грибными и бактериальными) сообществами в молоке, это дополнительно указывает на то, что управление хозяйством может влиять на качество молока. Необходимы дальнейшие исследования для изучения влияния различных микробных сообществ, ассоциированных с органическими и традиционными сельскохозяйственными системами, в навозе и молоке на здоровье коров, их последствий для потребления человеком и влияния на устойчивое производство молочных продуктов.

Дополнительный материал для этой статьи можно найти онлайн по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2020.01746/full#supplementary-material

Gomes SIF, van Bodegom PM, van Agtmaal M, Soudzilovskaia NA, Bestman M, Duijm E, Speksnijder A and van Eekeren N (2020) Microbiota in Dung and Milk Differ Between Organic and Conventional Dairy Farms. Front. Microbiol. 11:1746. doi: 10.3389/fmicb.2020.01746

Перевод статьи «Microbiota in Dung and Milk Differ Between Organic and Conventional Dairy Farms» авторов Gomes SIF, van Bodegom PM, van Agtmaal M, Soudzilovskaia NA, Bestman M, Duijm E, Speksnijder A and van Eekeren N., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык