Температурные аномалии в море: что они делают с бактериями и чем это грозит устричным фермам

Бактерии в прибрежных водах играют ключевую роль в глобальном биогеохимическом круговороте и тесно связаны с экологической безопасностью прибрежных зон. Бактериальное сообщество в прибрежных водах Северного Китая, используемых для выращивания моллюсков, имеет свои собственные характеристики и особенности, однако знания об этом ограничены. В данном исследовании изучались характеристики бактериального сообщества, особенности бактериального сообщества в водах с поверхностными холодными пятнами (ПХП), а также изменчивость патогенных бактерий в прибрежных водах Северного Жёлтого моря (СЖМ), используемых для марикультуры моллюсков, в период с 2017 по 2019 год.

Во всех исследованных образцах Desulfobacterales выступали в качестве ключевого таксона в сетях микробных ко-окуррентных взаимодействий, при этом относительная численность Actinobacteriota оказалась низкой и составила всего 1,3%. Обилие Marinobacter и Synechococcus было заметно выше среди 13 родов, обладающих функцией азоттрансформации. Двумя основными различными бактериальными функциями при пространственном анализе (между водами с ПХП и окружающими водами) были деградация ксенобиотиков и метаболизм, а также метаболизм кофакторов и витаминов, что совпало с результатами сезонного анализа (между весной и летом). Различия в численности большинства проанализированных патогенных бактерий в этом исследовании (11 из 12 родов) также демонстрировали одинаковую динамику изменений при пространственном и сезонном анализе. Для прогнозирования численности Vibrio была построена прогностическая модель на основе искусственной нейронной сети (ИНС), показавшая приемлемую точность прогноза. На основании приведённых выше результатов, бактериальное сообщество в аквакультурных водах в данном исследовании характеризовалось усилением способности к удалению азота. В качестве основного экологического фактора, определяющего изменчивость функций бактериального сообщества и структуры патогенных бактерий в прибрежных водах с ПХП, используемых для выращивания моллюсков, была определена температура. Результаты данного исследования углубят наше понимание характеристик бактериального сообщества в прибрежных водах марикультурных хозяйств, а также будут способствовать прогнозированию численности Vibrio и обеспечению экологической безопасности прибрежных акваторий.

Бактерии являются важными компонентами морской экосистемы, обеспечивая глобальный биогеохимический круговорот (Falkowski et al., 2008). Они играют важную роль в поддержании и устойчивости микробных пищевых сетей и способствуют быстрой адаптации к изменениям и ухудшению состояния морской среды (Dash et al., 2013). Морские планктонные бактерии, особенно те, которые распространены вблизи побережья, имеют важное значение в жизни людей из-за их тесной связи со здоровьем человека и животных, промышленностью и туризмом, поскольку около 60% населения мира проживает в пределах 100 км от побережья (Vitousek et al., 1997).

Моллюски считаются «ключевыми видами» и «инженерами экосистем» в прибрежной среде (Gutiérrez et al., 2003; Newell, 2004). Индустрия марикультуры моллюсков, которая всегда расположена вблизи побережья, значительно развилась в последние годы для удовлетворения растущего глобального спроса на белок (например, 17,7 млн тонн в 2018 году) и вносит вклад в мировое экономическое развитие (FAO, 2020). Известно, что моллюски изменяют микробные сообщества, фильтруя воду и перенося питательные вещества в водной системе. С одной стороны, марикультура моллюсков может снижать мутность воды и улучшать рециклинг питательных веществ в антропогенно нарушенной прибрежной среде, таким образом действуя как отличная система биоэкстракции питательных веществ в эвтрофных зонах. С другой стороны, фильтрация и осаждение взвешенных веществ при марикультуре моллюсков всегда вовлечены в регуляцию потоков питательных веществ и видообразование планктона, что иногда стимулирует рост видов планктона, вызывающих «красные приливы» (Dumbauld et al., 2009; He et al., 2017). Увеличение площадей выращивания и плотности посадки вызвало значительную обеспокоенность из-за их влияния на морскую среду (Yuan et al., 2010; Han et al., 2013). Несмотря на то, что имеются некоторые сообщения о микробиоме в прибрежной среде, выводы о динамике бактериального сообщества, полученные в разных исследованиях, не всегда хорошо согласуются из-за различных биогеографических и экологических особенностей (Hartwick et al., 2019). Влияние марикультуры моллюсков на микробное сообщество достаточно сложно, а понимание характеристик бактериального сообщества в прибрежных водах, используемых для выращивания моллюсков, весьма ограничено.

Северное Жёлтое море (СЖМ) прилегает к континентальному шельфу, имеющему важное экономическое значение для Китая и Кореи, и обладает уникальными океанографическими характеристиками. Марикультура моллюсков является важной отраслью в СЖМ и играет ключевую роль в развитии морской экономики. Она расположена вблизи прибрежных районов, особенно вокруг островов у побережья, где выращиваются ийесовский гребешок (Patinopecten yessoensis), тихоокеанская устрица (Crassostrea gigas) и морской гребешок (Argopecten irradians irradians) и др. В последние годы стоки с аквакультурных и промышленных предприятий, а также атмосферные выпадения также повлияли на концентрацию питательных веществ в СЖМ, что дополнительно привело к изменению микробного сообщества и его динамики и даже к образованию гипоксических мертвых зон (Lin et al., 2005; Tang, 2009). СЖМ всегда считается одним из самых сложных континентальных морских районов в мире из-за сезонной изменчивости сильных течений, ветрового напряжения и потоков пресной воды, обогащенной питательными веществами, в мелководном районе (Hur et al., 1999). Жёлтое море также хорошо известно благодаря Жёлтоморской холодной водной массе, которая представляет собой бассейновую водную массу с относительно низкой температурой, залегающую под сезонным термоклином. Поверхностные холодные пятна (ПХП) могут наблюдаться рассеянными вокруг Жёлтоморской холодной водной массы в бореальное лето, в отличие от окружающих вод с относительно более высокой температурой поверхности моря (Xia and Guo, 1983; Zou et al., 2001). Предполагалось, что экологическая особенность ПХП приводит к формированию различных бактериальных сообществ в водах, используемых для выращивания моллюсков, однако основной экологический параметр, участвующий в этом, не был ясен. Динамика изменчивости бактериального сообщества в СЖМ или даже в его прибрежных водах, используемых для выращивания моллюсков, в последние годы вызывает все больший интерес.

Патогенные бактерии в прибрежных водах тесно связаны со здоровьем человека и животных. Экологические проблемы, вызванные изменением микробиома, и инфекции, вызываемые патогенными бактериями, часто сообщались в водах, используемых для выращивания моллюсков (Azandégbé et al., 2012; He et al., 2017). Среди различных потенциальных патогенных бактерий модели распространения Vibrio spp. в морской среде привлекают широкое внимание, поскольку они включают некоторые патогенные виды, которые могут инфицировать человека и другие организмы, такие как V. parahaemolyticus и V. vulnificus. Патогенные виды Vibrio spp. в морской воде могут вызывать заболевания, передающиеся через морепродукты, при употреблении зараженных морепродуктов, а также вызывать инфицирование ран при контакте открытой раны с морской водой, что потенциально приводит к диарее, септицемии и даже смерти (Hsieh et al., 2008). Прогнозирование численности и вспышек Vibrio могло бы помочь предотвратить заболевания людей путем выявления и распространения прогностической информации и обеспечения ее общедоступности (Froelich et al., 2013; Izumiya et al., 2017).

Таким образом, исследование характеристик и динамики изменчивости бактериального сообщества и потенциально патогенных бактерий в прибрежных водах СЖМ, используемых для выращивания моллюсков, будет способствовать экологической безопасности прибрежных зон. Для достижения этой цели в настоящем исследовании пробы морской воды были отобраны в двух районах прибрежного выращивания моллюсков (воды с ПХП и окружающие воды) в СЖМ с марта по август 2017-2019 годов с целью: (1) осветить характеристики бактериального сообщества в прибрежных водах, используемых для выращивания моллюсков, и его сезонную динамику; (2) выявить особенности бактериального сообщества в водах с ПХП; (3) проанализировать модели изменчивости численности патогенных бактерий и разработать прогностическую модель для уровня численности Vibrio.

Отбор проб

Два района отбора проб (локация X и локация Z) были установлены для прибрежных вод СЖМ, используемых для выращивания ийесовского гребешка (Рисунок S1). Географические координаты локаций X и Z: N39°17'44" – E122°40'38" и N39°1'7" – E122°42'2" соответственно. Согласно Lü et al. (2010), локация X может рассматриваться как находящаяся в пределах ПХП, а локация Z – среди окружающего района с относительно более высокой температурой поверхности моря, поскольку наши трехлетние данные также показали, что температура поверхностной воды летом в локации X обычно на 2-3°C ниже, чем в локации Z. В каждый район входили три точки отбора проб в качестве трех повторностей. Эксперименты по отбору проб проводились с марта по август 2017-2019 годов, так как март-август является основным периодом выращивания гребешка. В данном исследовании весна определялась как период с марта по май, а лето – с июня по август. Пробы морской воды отбирались на глубине 3 м, где гребешки выращиваются на подвесных установках, и затем хранились при 4°C в течение 1 часа перед дальнейшей обработкой, как описано ранее (Yu et al., 2019a; Yu et al., 2019b).

Определение параметров воды

Температура воды (T), соленость (Sal), pH и растворенный кислород (DO) измерялись с помощью портативного прибора YSI Professional Plus (YSI, Yellow Springs, Ohio, USA) in situ. В соответствии с процедурами Национальной спецификации морского мониторинга (SOA of China, 2007), концентрации TAN, NO2–N, NO3–N, PO4-P и SiO4-Si в воде анализировались с использованием индофенольного синего спектрофотометрического метода, спектрофотометрического метода с N-(1-нафтил)-этилендиамин дигидрохлоридом, метода восстановления Zn-Cd, фосфорномолибденового синего спектрофотометрического метода и кремниймолибденового желтого спектрофотометрического метода соответственно. Концентрация Chl-a измерялась спектрофотометрически после экстракции ацетоном (Lorenzen, 1967).

Экстракция ДНК и высокопроизводительное секвенирование

Один литр морской воды фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм (Sagon, Shanghai, China) для обогащения микробных клеток для каждого образца, которые затем использовались для экстракции геномной ДНК с использованием набора Water DNA Kit (Omega, GA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Качество и количество ДНК анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и спектрофотометра NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, DE, USA). Высокопроизводительное секвенирование гипервариабельной области V3–V4 генов 16S рДНК выполнялось на платформе Illumina HiSeq компанией Novogene (Beijing, China) с фильтрацией ридов низкого качества.

Анализ ампликонных последовательностей

Сырые риды последовательностей 16S рДНК обрабатывались с использованием конвейера QIIME 2 (Quantitative Insights into Microbial Ecology) (Bolyen et al., 2019). Парноконцевые риды импортировались, затем обрезались и денишировались с использованием DADA2 для удаления химер и получения вариантов ампликонной последовательности (ASV). Численность азоттрансформирующих бактерий рассчитывалась как log10 (относительная доля численности  10000 + 1). Таксономия была назначена на уровне отдельных нуклеотидов для ASV с использованием классификатора признаков по обученной базе данных SILVA 138 SSU. Альфа-разнообразие и бета-разнообразие оценивались с использованием индекса Шеннона и расстояний Unweighted UniFrac соответственно.

Статистический анализ

MicrobiomeAnalyst (http://www.microbiomeanalyst.ca) использовался для сравнения численности и разнообразия бактериального сообщества и для визуального исследования с использованием данных ASV и файлов метаданных (Chong et al., 2020). Функциональные профили и метаболические пути бактериальных сообществ прогнозировались с использованием программного обеспечения PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States) (Douglas et al., 2020). База данных KEGG использовалась для аннотации прогнозируемых генов. Программное обеспечение STAMP использовалось для дифференциального анализа функциональных профилей (Parks et al., 2014). Сеть ко-окуррентных экологических взаимодействий была проанализирована с использованием онлайн-конвейера MENA (Molecular Ecological Network Analysis) (http://ieg2.ou.edu/MENA) (Deng et al., 2012), а построение сети выполнялось с использованием программного обеспечения Cytoscape (Shannon et al., 2003). Избыточный анализ (RDA) был проведен для выявления влияния экологических факторов на численность и разнообразие бактериальных сообществ с использованием программного обеспечения CANOCO (версия 5) (Šmilauer and Lepš, 2014). Корреляции между численностью Vibrio и экологическими факторами исследовались с помощью корреляционного анализа Спирмена и корреляционного анализа Пирсона с использованием статистического программного пакета SPSS 26 (SPSS Inc. Chicago, IL). Значение P<0,05 считалось статистически значимым. Значение P<0,01 считалось крайне значимым.

Построение прогностической модели

В этом исследовании была построена прогностическая модель для уровня численности Vibrio. Во-первых, с использованием конвейера MENA были исследованы взаимосвязи ко-окуррентности между численностью Vibrio и численностью бактерий на уровне отрядов для получения таксонов отрядов (VAO), которые были непосредственно связаны с изменчивостью Vibrio. Во-вторых, все протестированные экологические факторы и численность VAO были проанализированы на предмет их корреляции с численностью Vibrio в следующем месяце с использованием корреляционного анализа Спирмена и корреляционного анализа Пирсона для получения факторов (VAF, включая экологические факторы и таксоны отрядов), которые имели значимые ассоциации с изменчивостью Vibrio в следующем месяце в обоих результатах корреляционного анализа. В-третьих, были установлены три уровня относительной численности Vibrio: высокий уровень (доля численности ≥ 2%), средний уровень (2% > доля численности ≥ 0,5%) и низкий уровень (доля численности < 0,5%). Для построения и тестирования нейронной сети использовалось многослойное моделирование на основе искусственной нейронной сети (ИНС) с прямой связью с помощью SPSS 26, с использованием VAF в качестве входных переменных и уровня Vibrio в следующем месяце в качестве выходной переменной. Приемлемая модель ИНС была построена методом проб и ошибок. ИНС была разделена на три слоя, включая входной, скрытый и выходной слои. Три слоя обрабатывают сигналы и осуществляют поиск для получения наилучших линейных и нелинейных зависимостей между входными и выходными данными. В этой модели около 70% входных данных использовалось для обучения, а оставшиеся 30% – для тестирования. Алгоритм Левенберга–Марквардта применялся для моделирования и вычисления весов между входным, скрытым и выходным слоями путем изменения скорости обучения и количества скрытых слоев и нейронов.

Состав, функция и ко-окуррентность бактериального сообщества

Высокопроизводительное секвенирование 16S рДНК позволило получить 12 988 676 последовательностей, которые были сгруппированы в 16 747 ASV. Всего было обнаружено 415 отрядов из 56 типов во всех образцах путем прямой таксономической классификации и аннотации. Proteobacteria (58,6%), Bacteroidetes (18,6%), Cyanobacteria (12,3%), Firmicutes (3,4%) и Verrucomicrobiota (2,0%) были доминирующими типами в морской воде, составляя 95,0% от общей численности (Рисунок 1A). Средняя относительная доля Actinobacteriota составила 1,3%. Была исследована численность азоттрансформирующих бактерий, и в наших образцах было обнаружено 13 родов (Рисунок 2). Среди них Marinobacter и Synechococcus стабильно присутствовали во всех образцах, и их численность была заметно выше, чем у других азоттрансформирующих бактерий.

Рисунок 1 Состав, функция и ко-окуррентность бактериального сообщества. (A) Профили распределения таксонов на уровне типов и функциональных путей бактериального сообщества; (B) Сети микробной ко-окуррентности на уровне тип-отряд.

Рисунок 2 Изменчивость численности 13 родов азоттрансформирующих бактерий в прибрежных водах, используемых для выращивания моллюсков. По оси x – образцы в хронологическом порядке. Зеленый: 2017; синий: 2018; оранжевый: 2019.

Пути KEGG, в которые вовлечено бактериальное сообщество, были предсказаны для изучения потенциальных биосинтетических и экологических функций. Путем поиска в базе данных KEGG с использованием PICRUSt2 было идентифицировано в общей сложности 188 путей третьего уровня, включая биосинтез валина, лейцина и изолейцина, метаболизм C5-разветвленных двухосновных кислот и биосинтез ансамицинов и др. После группировки в пути второго уровня было определено 36 путей, включая метаболизм углеводов, инфекционные заболевания, репликацию и репарацию и др. Для дальнейшей группировки путей первого уровня было идентифицировано шесть типов (Рисунок 1A). Ко-окуррентный анализ был выполнен для изучения взаимосвязей взаимодействия между конкретными таксонами и построения сетей микробной ко-окуррентности. В общей сложности 114 отрядов (принадлежащих 22 типам) были включены в построение сети (Рисунок 1B). В целом, в этом результате были показаны сложные ко-окуррентные взаимосвязи для всего бактериального сообщества. Среди всех отрядов, перечисленных в этой работе, отряды в Proteobacteria занимали доминирующее положение в ко-окуррентных взаимосвязях, составляя 48,1% степени ко-окуррентности во всем микробиоме. Desulfobacterales были предложены в качестве ключевого таксона, поскольку они были наиболее непосредственно связаны среди всех отрядов в этой сети.

Что касается изменчивости состава бактериального сообщества между весной и летом, можно было наблюдать некоторые явные закономерности в разные годы, что свидетельствует о том, что бактериальные составы различались по межгодовым моделям (Рисунок 3A). В PCA-анализе бета-разнообразия бактерий бактериальное сообщество заметно различалось между весной и летом (Рисунок 3B). Это различие можно было более четко проследить при анализе по отдельным месяцам. Прогрессирующие изменения можно было проследить в моделях бактериального сообщества с марта по август (Рисунок 3B). Сравнения микробиома между весной и летом были проведены с помощью анализа LEfSe. Firmicutes и Bacteroidota были идентифицированы как дискриминативные признаки на уровне типов (Рисунок 3C). Семь таксонов на уровне родов были идентифицированы как дискриминативные признаки на уровне родов, при этом было обнаружено, что род Vibrio значительно обилен летом (Рисунок 3C). Изменчивость функциональных моделей бактерий была ярко выражена в сезонных масштабах, и сезонная изменчивость могла быть выявлена с помощью PCA-анализа (Рисунок 3D). Различные прогнозируемые пути между весной и летом были в основном связаны с метаболическими и клеточными функциональными путями, при этом двумя основными различными путями были деградация ксенобиотиков и метаболизм, а также метаболизм кофакторов и витаминов (Рисунок 3E). Пути, связанные с инфекционными заболеваниями, также были по-разному обогащены между весной и летом.

Рисунок 3 Временная изменчивость бактериального сообщества и его функций в районах выращивания моллюсков. (A) Тепловая карта годовой численности на уровне типов; (B) Сезонная (слева) и месячная (справа) изменчивость альфа-разнообразия; (C) Дискриминативные признаки бактериального сообщества на уровне типов (слева) и уровне родов (справа); (D) Анализ главных компонент (PCA) функциональной характеристики бактерий; (E) Функциональные пути со значимыми моделями временной изменчивости.

Характеристики состава и функций бактериального сообщества в водах с ПХП

Разница в альфа-разнообразии была незначительной между двумя локациями (Рисунок 4A). Различия можно было найти в некоторых наиболее доминирующих типах между локациями: образцы из локации X имели более высокую относительную численность Bacteroidota и Actinobacteriota и более низкую относительную численность Firmicutes (Рисунок 4B). Различия становились еще более выраженными в определенные сезоны или месяцы. Например, летом изменчивость шести типов, таких как Actinobacteriota, Planctomycetota и Patescibacteria и др., имела значительно различающиеся модели между двумя локациями (Рисунок 4C). При дальнейшем рассмотрении ситуации в августе Actinobacteriota был идентифицирован как единственный дискриминативный признак на уровне типов между двумя локациями по данным анализа LEfSe. Функциональные модели бактериального сообщества не различались заметно между локациями, но все же можно было наблюдать некоторые различия в PCA-анализе по оси PC1, которая объясняла 51,4% общей изменчивости (Рисунок 4D). Различные прогнозируемые пути между локациями были в основном обогащены в метаболических путях, при этом двумя основными различными путями были деградация ксенобиотиков и метаболизм, а также метаболизм кофакторов и витаминов (Рисунок 4E).

Рисунок 4 Пространственная изменчивость бактериального сообщества и его функций в районах выращивания моллюсков. (A) Альфа-разнообразие бактерий; (B) Относительная численность бактерий на уровне типов; (C) Типы со значимыми моделями пространственной изменчивости; (D) Анализ главных компонент (PCA) функциональной характеристики бактерий; (E) Функциональные пути со значимыми моделями пространственной изменчивости.

Модели изменчивости численности патогенных бактерий

В течение периода отбора проб в разные месяцы численность Vibrio в целом увеличивалась с повышением температуры (Рисунок 5). Для полного исследования сезонной изменчивости потенциальных патогенных бактерий была проанализирована численность 12 родов распространенных патогенных бактерий (Рисунок 6). При сравнении между весной и летом средняя численность пяти родов была выше весной, чем летом (кратность (log10 численности): 1,02-2,70), включая Shewanella, Pseudomonas, Streptococcus, Campylobacter и Escherichia. Средняя численность остальных семи родов была ниже весной, чем летом (кратность (log10 численности): 0,34-0,97), включая Vibrio, Aeromonas, Photobacterium, Francisella, Staphylococcus, Clostridium и Legionella. При сравнении между двумя локациями средняя численность четырех родов была выше в локации X, чем в локации Z (кратность (log10 численности): 1,02-1,41), включая Shewanella, Streptococcus, Campylobacter и Escherichia. Средняя численность восьми родов была ниже в локации X, чем в локации Z (кратность (log10 численности): 0,51-0,99), включая Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas, Photobacterium, Francisella, Staphylococcus, Clostridium и Legionella.

Рисунок 5 Месячная изменчивость численности Vibrio в районах выращивания моллюсков.

Рисунок 6 Временная и пространственная изменчивость численности 12 родов потенциально патогенных бактерий. X указывает на локацию X. Z указывает на локацию Z. Spr. указывает на весну. Sum. указывает на лето.

Взаимосвязи между экологическими факторами и бактериальным сообществом

Взаимосвязи между экологическими факторами и бактериальным сообществом были проанализированы и представлены на биплоте RDA (Рисунок 7A). Первая и вторая оси RDA объясняли 45,88% и 12,14% общей изменчивости соответственно. Тремя основными значимыми экологическими факторами, ограничивающими бактериальное сообщество, были DO, T и Chl-a с долей объяснения 33,6%, 33,4% и 28,3% соответственно. T и Chl-a оказывали сильное отрицательное влияние на численность большинства таксонов типов, расположенных в верхнем правом и нижнем правом квадрантах, в то время как DO оказывал сильное положительное влияние. WPS-2 в целом имел противоположную взаимосвязь с экологическими факторами по сравнению с некоторыми другими типами, которые имели положительную взаимосвязь с DO и отрицательную – с T и Chl-a. T и DO почти не влияли на численность SAR324. Для конкретных пар экологических факторов T и DO оказывали противоположное влияние на бактериальное сообщество, в то время как Chl-a и SiO4 оказывали сходное влияние на бактериальное сообщество. С помощью корреляционного анализа Спирмена и корреляционного анализа Пирсона были идентифицированы экологические факторы, которые были значимо связаны с численностью Vibrio в обоих анализах, включая T, DO, Chl-a, SiO4, PO4 и Si/N (Рисунок 7B). Экологическими факторами, коэффициенты корреляции которых превышали 0,5 в обоих анализах, были T и SiO4.

Рисунок 7 Взаимосвязи между экологическими факторами и бактериальным сообществом. (A) График RDA-упорядочения для первых двух главных измерений взаимосвязей между численностью таксонов типов и экологическими факторами в районах выращивания моллюсков. (B) Корреляция между численностью Vibrio и экологическими факторами с использованием корреляционного анализа Спирмена и корреляционного анализа Пирсона. «» обозначают крайне значимое различие (P<0,01).

Прогнозирование уровня численности Vibrio

Перед построением модели ИНС было обнаружено 41 VAO, непосредственно связанных с численностью Vibrio. После корреляционного анализа было обнаружено 32 VAF, значимо связанных с численностью Vibrio в следующем месяце. Один скрытый слой и 8 нейронов в скрытом слое были окончательно использованы для обучения модели ИНС, с отображением структуры на Рисунке 8A. Прогностическая точность показана в Таблице S1. Средняя прогностическая точность для обучающих образцов составила 95,8%, при этом каждая суб-точность превышала 85%. Средняя прогностическая точность для тестовых образцов составила 96,4%, при этом каждая суб-точность превышала 85%. Вероятность прогноза также можно увидеть на Рисунке 8B, что показывает приемлемую производительность модели ИНС для прогнозирования уровня численности Vibrio.

Рисунок 8 Искусственная нейронная сеть (ИНС) для прогнозирования численности Vibrio. (A) Структура слоя ИНС; (B) Вероятность прогноза модели ИНС для трех уровней численности Vibrio. «I, II, III» обозначают три уровня прогноза.

Характеристики бактериального сообщества в прибрежных водах, используемых для выращивания моллюсков, и его сезонная динамика

Доминирующие в наших образцах типы бактерий были исследованы и в целом соответствовали предыдущим исследованиям, в которых Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria и Actinobacteriota и др. характеризовались как наиболее распространенные типы в Жёлтом море или других прилегающих морских районах (Yu et al., 2018; Kim et al., 2019). Однако относительная доля Proteobacteria в этом исследовании (58,63%) относительно выше, чем в некоторых других исследованиях (обычно ниже 50%) (He et al., 2017; Yu et al., 2018). Более высокая численность Proteobacteria согласуется с их доминирующим положением в ко-окуррентных взаимосвязях микробиоты в этом исследовании. Proteobacteria всегда является доминирующим бактериальным таксоном в морской воде, и ее дальнейшее увеличение может вытеснять пространство других бактерий и снижать диверсификацию микробиоты.

Сезонная и месячная изменчивость бактериального сообщества была более выражена, чем межгодовая изменчивость, главным образом из-за внутригодовых изменений окружающей среды. Это соответствует здравому смыслу и согласуется с другими сообщениями. Kim et al. (2019) обнаружили, что численность бактерий тесно соответствовала хронологической сезонной модели в заливах Жёлтого моря, а временные модели микробных сообществ также наблюдались на побережье Нью-Джерси и в районе эстуария Жемчужной реки (Nelson et al., 2008; Xie et al., 2018). Прогрессирующие месячные изменения моделей бактериального сообщества, вероятно, были вызваны одним фактором, который непрерывно изменялся в одном направлении, которым, скорее всего, была температура воды. Температура воды всегда считалась одним из важнейших экологических факторов, определяющих бактериальное сообщество (Kim et al., 2019). Этот вывод также можно сделать на основании результатов RDA-анализа. Относительно высокая T и низкая DO летом могут играть важную роль в ограничении и формировании бактериального сообщества. Помимо T и DO, в настоящем исследовании Chl-a был еще одним важным экологическим фактором, связанным с изменчивостью бактериального сообщества. Предыдущие исследования также сообщали, что Chl-a был ключевым предиктором микробиоты, и некоторые таксоны бактерий были четко скоррелированы с Chl-a (Kim et al., 2019). Следует отметить, что марикультура моллюсков всегда оказывает большое влияние на численность и сообщество фитопланктона, поскольку фитопланктон является основным источником пищи для моллюсков. Таким образом, бактериальное сообщество в прибрежных водах, используемых для выращивания моллюсков, будет иметь специфические структурные модели, обусловленные изменчивостью фитопланктона.

В настоящем исследовании Desulfobacterales выступали в качестве ключевого таксона в ко-окуррентных взаимосвязях микробиоты и могут выполнять функцию в метаболизме азота с дальнейшим влиянием на другие бактериальные сообщества через круговорот азота. Desulfobacterales играют важную роль в круговороте и удалении азота и могут обеспечивать около 12% генов в азотных путях (Nie et al., 2021). Недавно доминирующие сульфатредуцирующие микроорганизмы (SRM) в пределах Desulfobacterales также были описаны в донных отложениях прибрежных экосистем устричных ферм (Mara et al., 2021). Относительная доля Actinobacteriota (1,3%) в этом исследовании была заметно ниже, чем в других исследованиях, где сообщалось о значениях до 5-20% (He et al., 2017; Yu et al., 2018). Было доказано, что численность Actinobacteriota сильно коррелирует с круговоротом азота, и они могут процветать в олиготрофных условиях и подавляться при высокой доступности органического вещества и неорганических питательных веществ (Kulaš et al., 2021; Wang et al., 2021). Влияние марикультуры моллюсков на круговорот азота исследовалось в предыдущих сообщениях с помощью анализа параметров качества воды/донных отложений (Erler et al., 2017; Jiang et al., 2020; Pan et al., 2021). Понимание характеристик бактериального сообщества, участвующего в круговороте азота в водах марикультуры моллюсков, весьма ограничено. Для дальнейшего изучения деталей азоттрансформирующей функции бактериального сообщества в нашем исследовании были исследованы распространенные азоттрансформирующие бактерии (Kuypers et al., 2018). Присутствие Marinobacter и Synechococcus было заметно выражено среди всех 13 родов с азоттрансформирующей функцией. Marinobacter и Synechococcus были в основном ответственны за процесс и удаление органического азота и NH4+ в морской воде. Характеристики бактериального сообщества, участвующие в круговороте азота, редко описывались в Жёлтом море (Bai et al., 2012; Yu et al., 2018; Jing et al., 2019; Yang et al., 2022). В совокупности приведенные выше результаты показывают, что бактериальное сообщество в аквакультурных водах в этом исследовании характеризовалось усилением способности к удалению азота.

Особенности бактериального сообщества в водах с ПХП

Бактериальное сообщество между двумя локациями имело меньшую изменчивость по сравнению с сезонной изменчивостью. Большая временная изменчивость и меньшая пространственная изменчивость бактериального сообщества также были обнаружены в районе Жёлтого моря и некоторых аквакультурных морских районах (He et al., 2017; Kim et al., 2019). Пространственная дифференциация может поверхностно маскировать экологические эффекты только тогда, когда физико-химические факторы тесно связаны с пространственными условиями. В противном случае устойчивая экологическая неоднородность перекрывает географические различия и напрямую формирует микробное разнообразие на промежуточных пространственных масштабах (Crossland et al., 2005; Wang et al., 2015).

ПХП является важной географической особенностью Жёлтого моря и некоторых других морей. Его формирование является результатом апвеллинга, который выносит холодную глубинную воду на поверхность моря. Более интенсивный водообмен в вертикальном направлении может изменять водную среду и приносить больше питательных веществ и взвешенных частиц из придонного слоя воды в поверхностный (Lü et al., 2010; Huang et al., 2018; Lin et al., 2019). В нашем исследовании изменчивость бактериального сообщества между двумя локациями имела более значительные различия летом, чем весной. Было высказано предположение, что различные географические условия могут приводить к изменчивости бактериального сообщества, главным образом через изменчивость экологических факторов. Экологические факторы всегда играют ключевую роль в пространственной изменчивости бактериального сообщества. Например, сообщалось, что различные уровни концентрации Chl-a отвечают за разнообразие бактериального сообщества между двумя станциями Жёлтого моря (Kim et al., 2019).

Интересно, что согласованность была обнаружена в двух аспектах между пространственным анализом (локация X против локации Z) и сезонным анализом (весна против лета). Во-первых, двумя основными различными прогнозируемыми путями микробной функции как в пространственном, так и в сезонном анализе были одни и те же пути – деградация ксенобиотиков и метаболизм, а также метаболизм кофакторов и витаминов, что может указывать на возникновение экологических стрессов и результирующую активацию стрессовых ответов (Huo et al., 2019; Ye et al., 2021). Во-вторых, 11 из 12 распространенных родов патогенных бактерий (за исключением Pseudomonas) имели одинаковые динамические модели в пространственном и сезонном анализах, иными словами, если численность одного рода патогенных бактерий была выше (или ниже) в водах с ПХП, чем в окружающих водах, то наиболее вероятно, что численность этого рода патогенных бактерий также была выше (или ниже) весной, чем летом. Температура была преобладающим экологическим фактором, определяющим сезонную динамику изменчивости бактериального сообщества между весной и летом. Температура также была наиболее критической характеристикой, отличающей воды с ПХП от окружающих вод. Поскольку существуют очень сходные динамические модели изменчивости бактериального сообщества между сезонным и пространственным анализами, разумно предположить, что температура является преобладающим экологическим фактором, определяющим изменчивость функции бактериального сообщества и моделей патогенных бактерий в прибрежных водах с ПХП, используемых для выращивания моллюсков.

Изменчивость численности Vibrio и построение прогностической модели

Численность Vibrio в целом увеличивалась с повышением температуры воды и демонстрировала четкие сезонные модели, что согласуется с некоторыми другими сообщениями (Hsieh et al., 2008; Vezzulli et al., 2009; Oberbeckmann et al., 2012; Froelich et al., 2015). Обогащение путей, связанных с инфекционными заболеваниями, летом предполагает, что риск от патогенных бактерий возрастает летом и требует большего внимания. Было обнаружено, что марикультура моллюсков играет важную роль в формировании характеристик Vibrio (Joye and Anderson, 2008; Feinman et al., 2018), вероятно, через нарушение структуры фитопланктона и зоопланктона, оба из которых служат детерминантами присутствия и численности Vibrio (Johnson, 2015). Существует много сообщений об изменчивости Vibrio в водной среде, в которых были идентифицированы ключевые экологические факторы, влияющие на сообщество Vibrio, и на основе экологических факторов предполагалась тенденция изменчивости Vibrio (Hsieh et al., 2008; Oberbeckmann et al., 2012; Johnson, 2015). В настоящем исследовании, помимо T, было также обнаружено, что SiO4-Si значимо связан с численностью Vibrio. Мы предполагаем, что: с одной стороны, SiO4-Si присутствует в толще морской воды в виде золя, который может обеспечивать субстрат для роста Vibrio. С другой стороны, фитопланктон и Chl-a являются ключевыми драйверами бактериального сообщества. SiO4-Si является важным компонентом некоторых таксонов фитопланктона, таких как диатомовые водоросли (DeLuca et al., 2020), и, таким образом, может влиять на численность Vibrio. Однако, как показано на Рисунке 6, численность Vibrio в одном и том же месяце разных лет заметно различалась на основе трехлетних данных, что свидетельствует о том, что оценивать численность Vibrio только на основе экологических факторов или исторических значений численности Vibrio нецелесообразно.

В последние годы были опубликованы некоторые исследования по созданию моделей и прогнозированию Vibrio. Hidemasa Izumiya et al. провели многоцелевое прибрежное исследование для изучения взаимосвязей между экологическими факторами и Vibrio и построили модель линейной регрессии для прогнозирования Vibrio (Izumiya et al., 2017). Brett Froelich et al. разработали пятипараметрическую механистическую модель для прогнозирования численности Vibrio в реке на основе экологических процессов (Froelich et al., 2013). Согласно предыдущим сообщениям, построение прогностической модели Vibrio следует улучшить в двух аспектах. Во-первых, в большинстве предыдущих исследований экологические факторы всегда включались в построение прогностической модели в качестве единственного типа входных переменных. Помимо экологических факторов, Vibrio также могут реагировать или быть связаны со многими другими водными бактериальными видами (Johnson, 2015) некоторыми способами, такими как кворум-сенсинг. Взаимодействия между Vibrio и другими бактериальными сообществами также должны быть включены в исследования прогнозирования Vibrio. Во-вторых, среди экологических факторов один фактор обычно имеет слабую или сильную зависимость от других. Трудно оценить исключительное влияние одного экологического фактора на численность Vibrio. Взаимосвязь между Vibrio и входными переменными прогностической модели не является прямой корреляцией, а скорее отношением, к которому вносят вклад многие переменные. Множественный регрессионный анализ не подходит для моделирования со слишком большим количеством входных переменных при построении прогностической модели Vibrio. Поэтому должна быть создана интегрированная модель, включающая экологические факторы и бактериальные виды в качестве входных переменных, чтобы лучше понимать изменчивость численности Vibrio.

Наше исследование улучшило прогностическое моделирование Vibrio путем: (1) включения экологических факторов, а также бактериальных видов в качестве входных переменных для более точного прогнозирования численности Vibrio; (2) использования ИНС для решения сложных картографических взаимосвязей между десятками входных переменных и численностью Vibrio и построения прогностической модели. Точность была приемлемой: 95,8% точности для обучающих образцов и 96,4% для тестовых образцов. Пространственный масштаб применения модели и точность будут дальнейше улучшены в наших будущих исследованиях путем включения большего количества данных для обучения модели, поскольку прогнозирование Vibrio лучше проводить с учетом региональных различий, а не использовать подход «один размер подходит всем». Результаты этого исследования будут способствовать усилиям по мониторингу и моделированию численности Vibrio в СЖМ для специфичного для региона прогнозирования Vibrio и прогнозирования риска для общественного здравоохранения.

Основные выводы, полученные в ходе данного исследования, следующие (Рисунок S2):

- Бактериальное сообщество в аквакультурных водах в этом исследовании характеризовалось усилением способности к удалению азота.

- Температура была преобладающим экологическим фактором, определяющим изменчивость функции бактериального сообщества и моделей патогенных бактерий в прибрежных водах с ПХП, используемых для выращивания моллюсков.

- В этом исследовании была построена прогностическая модель ИНС для численности Vibrio для прогнозирования Vibrio с приемлемой прогностической точностью.

Дополнительные материалы к этой статье можно найти онлайн по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmars.2022.997817/full#supplementary-material

Дополнительный рисунок 1

Локация X и локация Z были установлены как два района отбора проб для прибрежных вод СЖМ, используемых для выращивания ийесовского гребешка. Показано горизонтальное распределение средней температуры поверхности моря в августе 2004-2008 годов. Этот рисунок цитируется из (Lü et al., 2010).

Дополнительный рисунок 2

Графический реферат данного исследования.

Дополнительная таблица 1

Точность прогнозирования модели ИНС для численности Vibrio как для обучающих, так и для тестовых образцов.

Gao L, Yu Z, Liu C, Kong N, Wang L and Song L (2022) Characteristics and particularities of bacterial community variation in the offshore shellfish farming waters of the North Yellow Sea. Front. Mar. Sci. 9:997817. doi: 10.3389/fmars.2022.997817

Перевод статьи «Characteristics and particularities of bacterial community variation in the offshore shellfish farming waters of the North Yellow Sea» авторов Gao L, Yu Z, Liu C, Kong N, Wang L and Song L., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык

Фото: wikipedia