Опубликовано через час

Как лососёвые фермы влияют на обитателей морского дна

Выращивание лосося в садках всё чаще осуществляется в водоёмах с сильной гидродинамикой, где преобладают твёрдые и смешанные типы субстратов. Однако эти структурно сложные и неоднородные местообитания служат домом для разнообразных донных сообществ, включающих ряд книдарий и губок, которые остаются слабо изученными. В данном исследовании использовались методы респирометрии, газовой хроматографии и метабаркодинга 16S рРНК для определения интенсивности дыхания, соотношений стабильных изотопов углерода (δ¹³C) и азота (δ¹⁵N), профилей жирных кислот (ЖК) и микробных сообществ, а также для оценки влияния лососеводства на четыре важных вида эпибентосных организмов-фильтраторов у западного побережья Норвегии: губок Craniella и Weberella, мягкого коралла Duva florida и актинии Hormathia digitata.

Наши результаты показали выраженные различия в профилях жирных кислот и микробных сообществах хозяев (по составу, функциональным возможностям и генетическим свойствам) между изучаемыми видами фильтраторов. Мы обнаружили свидетельства повышенной смертности особей, расположенных вблизи рыболовных хозяйств, а также видоспецифичное влияние на интенсивность дыхания: у D. florida вблизи фермы наблюдалась повышенная активность. Воздействие рыболовства на фильтраторов также было видоспецифичным и особенно明显 проявлялось в функциональной перестройке микробных сообществ и изменении общего профиля жирных кислот у мягкого коралла и морской актинии. В частности, у D. florida было отмечено снижение содержания ЖК вблизи фермы (0–350 м) с достоверным изменением состава вдоль градиента расстояния. Только у H. digitata были обнаружены свидетельства включения органического материала из отходов рыбной фермы, выявленные с помощью трофических маркеров жирных кислот (FATM) и анализа стабильных изотопов.

В целом, наше исследование демонстрирует, что чувствительность организмов-фильтраторов к воздействию лососеводства зависит от их таксономической принадлежности, и позволяет идентифицировать несколько потенциальных молекулярных индикаторов, которые при дальнейших исследованиях и валидации могут быть использованы в качестве показателей градиента воздействия. Работа также представляет обширную экологическую и физиологическую информацию о некоторых из наиболее распространённых сидячих эпибентосных организмов в арктических и субарктических регионах, что позволяет лучше понять их реакцию и оценить их устойчивость к изменениям окружающей среды.

Мировое производство лосося в садках значительно выросло за последнее десятилетие и, по прогнозам, продолжит существенно расширяться в ближайшие 20 лет (FAO, 2018). В странах с высокой прибрежной плотностью производства, таких как Норвегия, этот рост, наряду с поиском оптимальных условий выращивания, привел к созданию новых производственных площадок во все более открытых и подверженных воздействию внешних факторов средах (Holmer, 2010; Lekang et al., 2016; Lader et al., 2017).

Характеризующиеся сложным рельефом, батиметрией и текстурой морского дна, эти сложные местообитания обычно поддерживают высокое, но при этом слабо изученное биоразнообразие (Sebens, 1991; Buhl-Mortensen et al., 2012; Dunlop et al., 2020). Такое биоразнообразие обычно представлено сидячими организмами, привязанными к твердому субстрату, такими как губки, мшанки и кораллы. Эти животные особенно уязвимы к воздействиям окружающей среды, включая седиментацию и заиливание, и, как было показано, чувствительны к деятельности лососевых ферм (Sutherland et al., 2018). Эти таксоны играют важную роль в функционировании экосистем благодаря своей способности переносить энергию между бентической и пелагической зонами, а также предоставлять среду обитания для множества других организмов (Klitgaard, 1995; Gili и Coma, 1998; Bell, 2008; Maldonado et al., 2015). Таким образом, они представляют собой подходящие объекты для оценки биологических эффектов аквакультуры лососевых на донные макроорганизмы в открытых средах.

Местообитания со смешанными и твердыми субстратами особенно сложно мониторить с помощью традиционных методов, таких как дночерпатели, из-за отсутствия или спорадического распределения мягких осадков, препятствий для закрывающих механизмов со стороны камней или боковых посадок дночерпателя на неровном морском дне (Dunlop et al., 2020). Видеосъемка использовалась как альтернатива для мониторинга бентических местообитаний, характеризующихся смешанными и твердыми субстратами, но обычно требует обширных наблюдений, и ее эффективность значительно снижается на сложных субстратах, где распределение макробентосной фауны неравномерно (Hamoutene et al., 2016; Hamoutene et al., 2018). Другие альтернативы включают аспирационные устройства, которые могут позволить характеризовать физико-химические свойства и изменения микробных сообществ путем сбора и анализа частиц, оседающих на морском дне. Хотя предварительные результаты обнадеживают (например, Keeley et al., 2021), эта методология все же не предоставляет информации о том, как изменение окружающей среды, связанное с лососеводством (например, органическое обогащение, заиливание, биоциды от обрастания и обработок от паразитов), влияет на макробентосную фауну. Понимание биологических ответных реакций этих организмов имеет фундаментальное значение для разработки индикаторов раннего предупреждения, позволяющих предотвратить серьезный и невосполнимый ущерб экосистеме.

Метабаркодинг ДНК и высокопроизводительное секвенирование представляют собой мощные инструменты для быстрого и экономически эффективного анализа микробных сообществ, включая микробиомы хозяев (Yang et al., 2019). Известно, что изменения микробиома следуют за физиологическими изменениями и патологическими состояниями у губок и кораллов или предшествуют им (Ribes et al., 2016; Ziegler et al., 2016; Gissi et al., 2019; Yang et al., 2019; Ziegler et al., 2019). Знание того, как изменяются микробиомы хозяев вдоль градиента воздействия, может быть полезным для оценки состояния здоровья хозяев, лучшего понимания того, как на них влияют факторы окружающей среды, и идентификации индикаторов стресса, которые можно включить в программы мониторинга (Schirmer et al., 2010; Clerissi et al., 2020; Dittami et al., 2021).

Другие распространенные методы отслеживания отходов аквакультуры в морских системах, которые могут быть применены к бентическим сидячим таксонам, включают анализ жирных кислот (ЖК) и стабильных изотопов (СИ). Корма для аквакультуры в основном производятся из наземных растений и, следовательно, обычно содержат высокие уровни наземных жирных кислот (таких как олеиновая кислота 18:1 (n-9), линолевая кислота 18:2 (n-6) и α-линоленовая кислота 18:3 (n-3)) и демонстрируют изотопную сигнатуру, обедненную δ13C и обогащенную δ15N по сравнению с морскими органическими соединениями (Sarà et al., 2006; Yokoyama et al., 2006; Fernandez-Jover et al., 2011; Woodcock et al., 2017a; White et al., 2019; Woodcock et al., 2019; Grego et al., 2020; Sun et al., 2020). Питаясь пеллетами и отходами аквакультуры, морские животные в непосредственной близости от лососевых ферм могут демонстрировать измененные профили ЖК и СИ, которые можно использовать для мониторинга градиента воздействия рыболовства.

Основываясь на этом, мы поставили целью оценить, происходят ли и каким образом эти изменения у четырех видов сидячих бентических организмов, обычно встречающихся на смешанных и твердых субстратах норвежского побережья, а именно: актинии Hormathia digitata, мягкого коралла Duva florida и губок Craniella и Weberella (Dunlop et al., 2020). Несколько экземпляров каждого таксона были перемещены вдоль градиента расстояния от лососевой фермы, расположенной в районе Согне-фьорда (средне-западное побережье Норвегии), и экспонировались в течение семи месяцев, после чего были извлечены и тщательно проанализированы. В частности, состояние здоровья и метаболизм образцов оценивались визуально и с помощью респирометрических измерений; их эпителиальный микробиом был охарактеризован с помощью метабаркодинга 16S рРНК; профиль ЖК оценен с помощью газовой хроматографии; а профиль стабильных изотопов углерода и азота измерен с помощью масс-спектрометрии. Мы предположили, что для каждого из бентических таксонов: 1) особи, находящиеся дальше от фермы, будут иметь более здоровую физиологию; 2) будут иметь микробиом, профили ЖК и СИ, которые значительно отличаются от особей, живущих в непосредственной близости от фермы; и 3) ответные реакции между бентическими таксонами будут существенно различаться из-за их внутренней специфической физиологии, экологии и зависимости от их микробиома.

2.1 Экспериментальная установка

Был проведен эксперимент по перемещению (транслокации) для использования градиента органического обогащения, создаваемого повышенным уровнем органических отходов, сбрасываемых с полностью функционирующей высокопроизводительной фермой по выращиванию лосося (Salmo salar) во фьорде в Северной Норвегии (Рисунок 1). В этом исследовании используются образцы с семи точек крепления для выращивания, расположенных вдоль трансекты, проходящей параллельно береговой линии (т.е. вдоль изобаты), в преобладающем направлении течения (ВСВ): 0 мА и 0 мБ (обе рядом с садками), 110 м, 360 м и 605 м (от садков) и на двух референсных станциях: Ref1 и Ref2 (на расстоянии 1500 м и 2080 м соответственно). Средняя скорость придонных течений составляла 0,086 м/с (Dunlop et al., 2021). Морское дно под точками крепления имело переменный уклон и состояло из местообитаний со смешанным и твердым дном (включая культивируемые виды), перемежающихся участками мягкого осадка (Dunlop et al., 2021; Keeley et al., 2021).

Рисунок 1 Район исследования в Варгсундете, Северная Норвегия (A) с расположением семи установок для транслокации по отношению к рыбоводной ферме (B), и внизу примеры фотографий четырех выбранных видов, сделанные перед переносом в рамы для выращивания.

2.2 Выбор видов

Для контролируемой in-situ экспозиции к отходам фермы и последующих тестов и детального анализа тканей были выбраны четыре вида сидячей бентосной эпифауны из района Варгсундет в Северной Норвегии. Критерии отбора включали: наличие различных предполагаемых чувствительностей к седиментации и давлению органического обогащения, относительно повсеместное распространение на твердых субстратах в регионе, наличие у выбранных видов некоторых контрастных физиологических форм и механизмов питания и, наконец, достаточную численность и возможность физического отбора проб (с помощью ТНПА) в зоне сбора. Выбранными видами были: два вида губок (Craniella и Weberella), обыкновенная красная актиния (Hormathia digitata) и мягкий коралл (Duva florida) (Рисунок 1).

2.3 Сбор и перемещение для выращивания

Образцы четырех целевых видов были собраны на близлежащем рифе примерно в 2800 м от фермы на сопоставимых глубинах (~80 м) с местами транслокации (Рисунок 1) с использованием ТНПА со специально сконструированной гибкой (мягкий захват) поверхностно-управляемой клешней. Отбирались «свободные» или «полусвободные» экземпляры, которые затем помещались в резервуар ТНПА, после чего поднимались на поверхность и непосредственно переносились в бортовую емкость для хранения. Чтобы избежать необходимости насильственного отрыва от субстрата и создания неизвестного объема повреждений тканей и стресса, выбранные экземпляры либо слабо прикреплялись к рыхлому субстрату и поэтому легко удалялись (Craniella), либо были прикреплены к небольшим камням на мягком осадке (в основном Weberella и D. florida), либо, в случае H. digitata, были прикреплены к раковинам подвижных брюхоногих моллюсков. На борту образцы были индивидуально взвешены, сфотографированы и промаркированы, затем перенесены в раму для выращивания и закреплены, будучи погруженными в воду, чтобы избежать контакта с воздухом (т.е. переносились в ведрах). Рама для выращивания состояла из четырех круглых сетчатых дисков (диаметром 400 мм), установленных на расстоянии 350 мм друг от друга с помощью предварительно нарезанных полиэтиленовых труб на центральной стойке (резьбовой стержень из нержавеющей стали), аналогичных используемым в качестве «фонарей-сетей» для выращивания двустворчатых моллюсков. Для этого внешняя сетка (или «чулок») была удалена, чтобы обеспечить полное воздействие на культивируемую поверхность гидродинамики участка, сестона, поступления кислорода и событий биоосаждения, подобно тому, с чем они сталкивались бы на морском дне. Рамы для выращивания были развернуты вблизи морского дна (ок. 2–3 м над дном) на швартовных тросах в сопоставимом диапазоне глубин. Фауна культивировалась на перемещенных позициях в течение 7 месяцев, с середины марта (15–18 марта 2018 г.) до извлечения в середине октября (15–23 октября 2018 г.).

2.4 Показатели стресса и жизнеспособности

Ответные реакции фауны на эксперименты по транслокации оценивались с помощью различных подходов. Во-первых, рассчитывался простой уровень смертности для каждого вида на основе количества неповрежденных «живых» экземпляров, извлеченных при поднятии рам по окончании испытания. Экземпляры считались погибшими, если они полностью исчезли (предположительно разложились и отпали) или от них остался только остаток, и было очевидно, что они погибли. Во-вторых, частота дыхания каждой особи определялась на основе потребления кислорода. Наконец, фауна умерщвлялась и препарировалась радиально в полустерильных условиях (новые перчатки, чистая разделочная доска и скальпель между особями) для получения примерно 10 г ткани из поперечного среза (сегмента) животного, который затем помещался в предварительно маркированные пробирки Эппендорфа и замораживался в жидком азоте. Субобразцы затем подвергались специальному анализу для оценки: 1. микробиома, 2. жирнокислотного состава и 3. содержания углерода и азота (включая соотношения стабильных изотопов δ15N и δ13C).

2.5 Респирометрические эксперименты

После извлечения каждый экземпляр фауны сначала осторожно снимался с рамы для выращивания (под водой) и переносился в проточные емкости для выдерживания, где оставлялся неподвижно и вдали от прямого солнечного света минимум на 12 часов, прежде чем быть осторожно перенесенным в респирометрическую камеру подходящего размера. В каждую камеру были подведены индивидуальные линии подачи воды для обеспечения мягкой замены воды, пока образец адаптировался к новой среде и восстанавливался после перемещения. В случае актинии и мягкого коралла это проявлялось в раскрытии и вытягивании животного, поскольку оба этих вида могут сжиматься в маленький шарик при беспокойстве, в течение которого они, предположительно, находятся в состоянии покоя и не дышат с нормальной интенсивностью. Затем линия подачи воды в камеру удалялась, и на верхнюю часть камеры помещалась герметичная крышка, содержащая цифровой датчик кислорода и микронасос, который включался для перемешивания воды, предотвращая хемостратификацию. Концентрация кислорода в камере регистрировалась с помощью 8-канального волоконно-оптического кислородного передатчика PresSense OXY-8 SMA (G3) (с кислородными зондами St10-YOP и датчиком температуры Pt-100), и эксперимент проводился до тех пор, пока не наблюдалась стабильная скорость убыли кислорода, а концентрация не снижалась до заметного уровня. Эксперименты завершались до того, как концентрация падала ниже 80%, и перезапускались, если животное визуально закрывалось (например, актиния или мягкий коралл сжимались). Каждая особь подвергалась двум последовательным испытаниям с обновлением воды в камере между ними. После удаления образца для препарировки измерялся объем камеры.

Скорость потребления кислорода рассчитывалась путем первоначального построения временного ряда кислорода и идентификации наиболее раннего стабильного и согласованного участка кривой. Затем этот участок случайным образом субдискретизировался для получения множественных измерений наклона, которые затем преобразовывались в среднее потребление кислорода на основе объема морской воды в соответствующих инкубационных камерах.

2.6 Анализ ДНК

2.6.1 Экстракция ДНК

Замороженные образцы тканей (-80°C) измельчались и гомогенизировались в жидком азоте с использованием стерилизованной ступки и пестика, замоченных в 50% растворе коммерческой отбеливающей жидкости (0,564 моль/л) в течение минимум 5 минут и ополаскиваемых дважды дистиллированной водой (ддH2O) между каждым образцом. Для каждого образца примерно 25 мг порошкообразной замороженной ткани лизировали с использованием набора QIAshredder (QIAGEN, Калифорния, США), а ДНК/РНК совместно экстрагировали с использованием набора AllPrep DNA/RNA mini kit (QIAGEN, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Для оценки потенциального загрязнения для каждой партии экстракции включали контроль экстракции, заполненный ддH2O.

2.6.2 Таксономическая идентификация образцов с помощью секвенирования по Сенгеру

Для обеспечения правильной таксономической идентификации собранных бентических образцов несколько особей из каждой группы были секвенированы по методу Сенгера. Подробности методологии и результаты приведены в дополнительном файле 1 (Таблицы S1-S2 и Рисунки S1-S5).

2.6.3 Подготовка библиотеки для метабаркодинга 16S рРНК

Экстракты ДНК были уравнены до эквимолярной концентрации (10 нг/мкл) с 10 мМ Трис до общего объема 20 мкл на образец и отправлены в сухом льду в Норвежский центр секвенирования (NSC, Осло, Норвегия) для подготовки библиотеки 16S рРНК по протоколу Fadrosh et al. (2014). Кратко: для амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовались слитые праймеры, содержащие адаптеры Illumina, 12-парный (п.н.) индекс образца, гетерогенный спейсер от 0 до 7 п.н. [для смягчения проблемы образцов с низким разнообразием (Krueger et al., 2011)] и универсальные праймеры для 16S рРНК, направленные на участок V3-V4 (~469 п.н.): прямой 319F: 5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG’ или обратный 806R: 5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’. Ампликоны очищали и нормализовали с использованием набора SequalPrep™ (Life Technologies, Калифорния, США), объединяли и секвенировали со спаренными концами (2x300 п.н.) на платформе Illumina MiSeq (Калифорния, США). Для оценки потенциального загрязнения во время подготовки библиотеки добавляли ПЦР-контроль (ддH2O). Последовательности доступны в архиве NCBI Sequence Read Archive под номером проекта PRJNA694725.

2.6.4 Биоинформатический анализ данных 16S рРНК

Fastq-файлы были демультиплексированы, а праймеры обрезаны с использованием cutadapt (версия 2.6; Martin, 2011), без вставок или делеций и с минимальным перекрытием в 15 п.н. Затем последовательности были подвергнуты фильтрации по качеству и денизации с настройками по умолчанию программы DADA2 в R (версия 1.14; Callahan et al., 2016). Прямые и обратные чтения были объединены с использованием настроек по умолчанию и минимального перекрытия в 10 п.н. Фильтрация химер проводилась с использованием консенсусного метода, при котором последовательности, признанные химерными в большинстве образцов (значение по умолчанию = 90%), отбрасывались. Оставшиеся последовательности были таксономически классифицированы с использованием алгоритма RDP Naïve Bayesian Classifier (Wang et al., 2007), обученного на базе данных SILVA 16S рРНК (версия 132, кластеризованная при 99% сходстве). Небактериальные последовательности и последовательности, отнесенные к хлоропластам, были удалены из набора данных. Кроме того, для дальнейшего анализа были оставлены только последовательности с минимумом 10 чтений для удаления потенциально ошибочных чтений. Глубина секвенирования на образец визуализировалась с помощью функции «rarecurve» пакета «vegan» в R (версия 2.5.6; Oksanen et al., 2019). Образцы с менее чем 1000 чтений были исключены. Полученные образцы и последовательности использовались для профилирования функциональных свойств [номера Комиссии по ферментам (EC) и пути] и генетических свойств (т.е. средний размер генома, среднее содержание G/C, средняя пластичность генома) с использованием программы Paprica (версия 0.5.2; Bowman и Ducklow, 2015) с параметрами по умолчанию. Кроме того, функциональное профилирование также выполнялось с помощью программного обеспечения Tax4Fun2 (версия 1.1.4; Wemheuer et al., 2020) и базы данных KEGG Orthologs (KOs) для охвата путей, отсутствующих в базе данных EC.

2.7 Анализ стабильных изотопов

Субобразец гомогенизированной ткани каждого образца сушили при 60°C в течение 24 часов и отвешивали в оловянную капсулу (1,28 ± 0,15 мг). Все образцы были отправлены в Лабораторию стабильных изотопов Калифорнийского университета (кампус в Дэвисе, Калифорния, США). Образцы анализировались на содержание δ15N и δ13C с использованием масс-спектрометра для измерения соотношения изотопов PDZ Europa 20-20 (Sercon). Соотношения стабильных изотопов выражались в дельта-нотации по следующей формуле:

где X — тяжелый изотоп, R_образца — отношение тяжелого к легкому изотопу в образце, а R_стандарта — отношение тяжелого к легкому изотопу в эталонном стандарте. Среднее стандартное отклонение для реплик эталонных материалов в этом проекте составляет 0,06 ‰ как для δ15N, так и для δ13C. Помимо соотношения двух стабильных изотопов (δ15N и δ13C), анализ также предоставляет общее количество углерода и азота в процентах от сухого веса.

2.8 Анализ жирных кислот

Образец каждого экземпляра (1-2 г) гомогенизировали скальпелем, и субобразец (50-150 мг) отвешивали в стеклянную пробирку объемом 16 мл для анализа жирных кислот. Дополнительные субобразцы весом 1,5-2 г отвешивали на алюминиевые чашки для измерения содержания воды и золы. Для количественного определения липидов относительно беззольного сухого веса (общий вес образца – вода – зола) измельченный тканевый материал сушили в течение ночи при 110°C для определения содержания воды, затем образцы сжигали при 450°C в течение 6 часов для определения веса золы. Затем липиды определялись количественно относительно беззольного сухого веса (общий вес образца – вода – зола).

Все образцы метилировали, и соответствующие метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) анализировали на газовом хроматографе HP-7890A (Agilent, США) с пламенно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД) в соответствии с методом, описанным в Meier et al. (2006), с добавлением жирной кислоты 19:0 в качестве внутреннего стандарта. В качестве метилирующего реагента использовали 2,5 М сухой HCl в метаноле. МЭЖК экстрагировали с использованием 2×2 мл гексана. Объединенный экстракт разбавляли или концентрировали для получения подходящей концентрации для газовой хроматографии, после чего 1 мкл вводили (без деления потока) в ГХ.

Четыре различных животных, проанализированных в этом исследовании, имеют очень разный липидный состав, что потребовало нескольких индивидуальных модификаций стандартных методов для анализа состава жирных кислот и жирных спиртов (ЖС). Модификации, примененные к каждому таксону, обобщены в Таблице 1 и подробно описаны ниже в тексте.

Таблица 1 Модификация метода анализа жирных кислот и жирных спиртов по таксонам.

Поскольку образцы морских актиний содержат большое количество восковых эфиров, МЭЖК и жирные спирты (ЖС) были разделены на твердофазной колонке (500 мг аминопропил-ТФЭ, Supelco). Фракции МЭЖК и ЖС анализировались отдельно на ГХ-ПИД для избежания совместной элюции. Образцы морских актиний сначала метилировали, и в полученные гексановые экстракты из прямого метанолиза добавляли нонадеканол (спирт 19:0) в качестве внутреннего стандарта для ЖС. Гексановый экстракт наносили на ТФЭ-колонку, фракцию МЭЖК элюировали 3 мл гексана + 2 мл гексана:этилацетата (9:1 об./об.), а жирные спирты элюировали 4 мл хлороформа. Две фракции упаривали досуха и растворяли в гексане перед анализом ГХ-ПИД.

Мягкий коралл содержит большое количество углеводородов (УВ), которые соэлюируются с МЭЖК. Чтобы устранить эту проблему, после первого метанолиза проводили омыление для удаления УВ, с обратной экстракцией свободных жирных кислот (СЖК) с последующим дополнительным метанолизом. Гексановый экстракт после первого метанолиза переносили в реакционную пробирку объемом 16 мл, гексан упаривали досуха с помощью N2 (г) и добавляли 1 мл 1 М KOH (водн.). Реакционную пробирку нагревали при 90°C в течение 1 часа, после охлаждения добавляли 2,5 мл H2O, после чего проводили экстракцию УВ с помощью 2×2 мл изооктана. Водную фракцию, содержащую свободные жирные кислоты (СЖК), подкисляли добавлением 2 мл 2 М HCl (водн.), и ЖК экстрагировали с помощью 2×2 мл изооктана. Органическую фракцию переносили в новую реакционную пробирку объемом 16 мл, упаривали досуха с помощью N2 (г), и СЖК метилировали в МЭЖК согласно вышеупомянутой процедуре.

Экстракты МЭЖК/ЖС из Weberella, Hormathia digitata и Duva florida анализировали на колонке CP-Wax 52 CB (25 м × 0,25 мм, плавленый кварцевый капилляр, покрытый полиэтиленгликолем с толщиной пленки 0,25 мкм, Varian-Chrompack, Мидделбург, Нидерланды). Температура печи программировалась: выдержка при 90°C в течение 2 минут, затем подъем от 90°C до 150°C со скоростью 30°C/мин, затем до 225°C со скоростью 2,5°C/мин и выдержка при этой температуре в течение 35 минут, общее время анализа 75 минут. Гелий (99,9999%) использовался в качестве подвижной фазы при 1 мл/мин в течение 45 минут, затем с увеличением расхода до 3 мл/мин, который поддерживался в течение 30 минут. Температуры инжектора и детектора составляли 270°C и 300°C соответственно.

Экстракт МЭЖК из Craniella анализировали на колонке Agilent 122-5062 DB-5 (60 м × 0,25 мм × 0,25 мкм) с гелием в качестве газа-носителя при постоянном расходе 1 мл/мин. Температура печи выдерживалась при 60°C, затем поднималась до 130°C со скоростью 60°C/мин, затем до 325°C со скоростью 1°C/мин и выдерживалась при этой температуре в течение 7 минут. Условия впрыска и детектирования были такими, как описано выше. Хроматограммы интегрировались с использованием программного обеспечения EZChrom Elite (Agilent Technologies). Идентификация МЭЖК и других липидов проводилась путем сравнения времени удерживания со стандартом МЭЖК (GLC-463 от Nu-Chek Prep., Элизиан, Миннесота, США), выполненным в аналогичных хроматографических условиях, что и ГХ-ПИД (Wasta и Mjøs, 2013). Газохромато-масс-спектрометрический анализ всех образцов проводился с использованием электронной ударной ионизации (Agilent Technologies, система 6890N/5975B ГХ-МС, Санта-Клара, Калифорния, США). Таблица с идентификацией МЭЖК и других липидов из анализа ГХ-МС приведена в дополнительном файле 2. Карты индексов удерживания и библиотеки масс-спектров можно найти по адресу (ГХ-МС; http://www.chrombox.org/data).

Положение двойных связей нон-метилен-прерванных жирных кислот (НМП-ЖК) не указано, поскольку эталонные соединения недоступны, а количества были слишком малы для применения специальных методов дериватизации для установления структуры (таких как пиколиниловые эфиры или производные диметилдисульфида), которые могли бы подтвердить положения. Буквы (a/b) используются для обозначения различных изомеров НМП. Однако известно, что доминирующее ненасыщение НМП-ЖК для Demospongiae находится в положении Δ5,9, и вполне вероятно, что двумя доминирующими НМП-ЖК в Weberella являются 26:2 НМП (a) = 26:2 (Δ5,9) и 26:3 НМП (b) = 26:3 (Δ5,9,19) (Hahn et al., 1988; Kornprobst и Barnathan, 2010; de Kluijver et al., 2021).

В Craniella доминирующей НМП-ПНЖК была разветвленная C27. Поскольку возможно несколько изомеров, мы не смогли из нашего анализа оценить положение двойной связи или разветвления (de Kluijver et al., 2021). Положение метильной группы разветвленных насыщенных ЖК в Craniella было получено с использованием индекса удерживания (эквивалентная длина цепи, ЭДЦ) из Kubinec et al. (2011).

2.9 Анализ данных и статистика

Таксономическое и функциональное микробное богатство и средние микробные генетические свойства [т.е. среднее и стандартное отклонение последовательностей 16S рРНК, количество генов, количество кодирующих последовательностей (КП), размер генома, содержание GC и пластичность генома (phi) по таксонам] визуализировались и сравнивались между бентическими видами с помощью ящичковых диаграмм и пакета «ggplot2» в R (версия 3.3; Wickham, 2016) и проверялись с помощью дисперсионного анализа (ANOVA; дизайн: корень 4-й степени из расстояния от садка бентический вид) с использованием функции «stats», реализованной в базовом R. Кроме того, были добавлены значения для образцов осадка и флока (частичного органического вещества, осевшего на твердых смешанных и твердых субстратах), собранных вдоль той же трансекты в том же году эксперимента (см. Keeley et al., 2021), для возможности сравнения с окружающей средой. Доля общих вариантов ампликонных последовательностей (ASV) и номеров EC между таксонами оценивалась с помощью диаграмм Венна и пакета «eulerr» в R (версия 6.1.0; Larsson 2020).

Различия в составе микробных сообществ и генетических свойствах между бентическими видами и по градиенту расстояния от садка визуализировались с помощью анализа главных компонент (PCO) с использованием матриц евклидова расстояния для данных, преобразованных в относительную численность, и проверялись на наличие значительных различий с помощью перестановочного дисперсионного анализа (PERMANOVA; дизайн: корень 4-й степени из расстояния от фермы бентический вид) с использованием функции «adonis» пакета «vegan» в R. Аналогично, различия в генетических свойствах микробиома хозяев оценивались на наличие значительных различий между бентическими видами и по градиенту расстояния от садка с помощью PERMANOVA (дизайн: корень 4-й степени из расстояния от фермы бентический вид). Общая дисперсия внутри групп по расстоянию от фермы также исследовалась для таксономических и функциональных микробных профилей с использованием функции «betadisper» пакета «vegan» в R и визуализировалась с помощью ящичковых диаграмм.

Бактериальные таксоны и функции, ассоциированные с деятельностью рыбоводных ферм, оценивались с использованием пакета «DeSeq2» в R (версия 1.26.0; Love et al., 2014), с корнем 4-й степени из расстояния от садка в качестве фактора. Бактерии, обнаруженные как значимо связанные с градиентом воздействия, были проверены по базе данных Американской ассоциации биологической безопасности (ABSA) (https://my.absa.org/Riskgroups) для идентификации потенциальных патогенных таксонов.

Трофические маркеры жирных кислот (ТМЖК) были рассчитаны для нескольких первичных и вторичных продуцентов: бактериальных, микропланктонных (диатомовые и жгутиковые), каляноидных копепод и наземных маркеров в соответствии с Dalsgaard et al. (2003) (обзор в Таблице S9). ТМЖК для демоспонгий были рассчитаны с использованием суммы длинноцепочечных НМП-ПНЖК (C24-C29) в соответствии с de Kluijver et al. (2021). Суммы важных классов ЖК (например, насыщенные ЖК (НЖК), мононенасыщенные ЖК (МНЖК), полиненасыщенные ЖК (ПНЖК), ПНЖК омега-3 (n-3 ПНЖК); ПНЖК омега-6 (n-6 ПНЖК)) также были рассчитаны для изучения того, как содержание ЖК в губках и кораллах варьируется между видами и условиями. Взаимосвязь этих основных классов и ТМЖК с расстоянием от деятельности рыбоводных ферм (преобразованным в корень 4-й степени) исследовалась с помощью графиков регрессии, используя функцию «ggscatter» пакета «ggpubr» в R (версия 0.4.0; Kassambara, 2020). Различия в жирнокислотном составе между бентическими видами и по градиенту расстояния от садка визуализировались с помощью анализа главных компонент (PCA) с использованием матриц евклидова расстояния для данных, преобразованных в относительную численность, и проверялись на наличие значительных различий с помощью перестановочного дисперсионного анализа (PERMANOVA; дизайн: корень 4-й степени из расстояния от фермы бентический вид) с использованием функции «adonis» пакета «vegan» в R.

Корреляции Пирсона между профилями микробиома и жирных кислот глобально проверялись с помощью «protest» с использованием пакета «vegan» в R и индивидуально проверялись для каждой микробной функции и жирной кислоты с использованием функции «cor» базового R.

3.1 Выживаемость перемещенных образцов

Доля экземпляров, погибших во время эксперимента, была самой высокой для мягкого коралла (D. florida), за которым следовали две губки Craniella и Weberella, и актиния H. digitata (Рисунок 2). Все таксоны имели тенденцию к более низкой выживаемости (R от 0,23 до 0,88) ближе к садку, причем значимая взаимосвязь с расстоянием от садка наблюдалась как для H. digitata, так и для Weberella (Рисунок 2).

Рисунок 2 Круговая диаграмма (A) экземпляров на бентический таксон, которые выжили, погибли или предположительно потеряны, и точечная диаграмма (B) с линией регрессии и доверительным интервалом (затененная область) выживаемости (исключая потерянные экземпляры) по корню 4-й степени из расстояния от садка.

3.2 Скорость дыхания

Craniella имела значительно (aov p.value < 0,001) более высокую скорость потребления кислорода (в среднем 1,5 мг O2·л⁻¹·особь⁻¹), чем три других вида, у которых значения в среднем составляли от 0,66 до 0,80 мг O2·л⁻¹·особь⁻¹ (Рисунок S5). Четкой тенденции в зависимости от расстояния от садка не наблюдалось.

Когда скорость потребления кислорода была стандартизирована по массе организма, мягкий коралл D. florida имел значительно более высокую скорость потребления по сравнению с тремя другими видами (в среднем 0,12 мг O2·л⁻¹·г⁻¹ по сравнению с 0,012–0,032 мг O2·л⁻¹·г⁻¹) (Рисунок S5). Что касается расстояния от фермы (т.е. станции), только D. florida показала сильную и значимую отрицательную корреляцию (R = -0,51, p.value = 0,006), указывающую на повышенную скорость дыхания вблизи садка.

3.3 Высокопроизводительное секвенирование 16S рРНК

Из общего числа 142 образцов (исключая контроли) у 25 не удалось получить ПЦР-продукт (Таблица S3). Эти образцы принадлежали в основном актинии H. digitata (17 из 35 экземпляров) и мягкому кораллу D. florida (7 из 34 экземпляров). Всего было секвенировано 13 553 694 чтения (в среднем 110 192 на образец). Из них 48% были отброшены после фильтрации по качеству, 1,1% после денизации и 14,6% после объединения и удаления химерных последовательностей. После этих этапов предварительной обработки последовательности контролей не сохранились. Небактериальные последовательности, а также последовательности, не идентифицированные на уровне царства или отнесенные к хлоропластам, составили 23 и 14,3% чтений и ASV соответственно и были удалены из набора данных, наряду с редкими ASV (менее 10 чтений), в результате чего осталось 4 303 153 чтения и 1688 ASV. Все образцы с минимумом 1000 чтений достигли полного покрытия последовательностей (Рисунок S7).

3.3.1 Таксономический состав микробиома

Состав на уровне типов и семейств сильно различался между эпибентическими таксонами и даже между двумя губками (Рисунок 3). Кроме того, можно было наблюдать сильную вариацию относительной численности бактериальных таксонов между бентическими образцами одного и того же вида/рода. В целом, образцы Craniella были склонны к доминированию Proteobacteria, таких как Nitrosococcaceae и Nisaeaceae, Chloroflexi, таких как A4b, и Actinobacteria семейства Microtrichaceae. С другой стороны, образцы Weberella состояли в основном из Nitrospinaceae и Proteobacteria семейства Thermopetrobacteraceae. Актиния и мягкий коралл также имели сильно различающиеся микробиомы: D. florida в основном состоял из Endozoicomonadaceae (Proteobacteria) и Mycoplasmataceae (Tenericutes), а H. digitata — из Flavobacteriaceae (Bacteroidetes) и различных Proteobacteria.

Рисунок 3 Столбчатые диаграммы бактериального таксономического состава (семейства и типы) образцов по эпибентическим таксонам в зависимости от расстояния от рыбоводной фермы.

Двенадцать семейств были уникальны для H. digitata, включая Ardenticatenaceae, Chitinophagaceae, Coxiellaceae, Ectothiorhodospiraceae, Fibrobacteraceae, Kiritimatiellaceae, Helicobacteraceae, Pseudomonadaceae и Staphylococcaceae (Рисунок 4). Несколько семейств также были уникальны для образцов Craniella, таких как Desulfovibrionaceae, Leptotrichiaceae, Puniceispirillales и Rhodospirillaceae. Образцы D. florida содержали три уникальных семейства, включая Simkaniaceae и Spirosomaceae, в то время как особи Weberella состояли из двух уникальных семейств, а именно Thermopetrobacteraceae и UBAS12411.

Рисунок 4 Диаграммы Венна общих бактериальных таксономических (ASV) и функциональных (EC) сообществ между эпибентическими таксонами. Также отображены семейства и пути, уникальные для каждого таксона. ASV — варианты ампликонных последовательностей; EC — номера Комиссии по ферментам.

В общем, основной микробиом (ASV, общие для всех экземпляров) для каждого эпибентического таксона составлял лишь очень малую долю (от 0 для Weberella до 3,4% для Craniella) сообщества (Рисунок 5). ASV, обнаруженные в 75% экземпляров, все еще составляли небольшую долю (от 0,8% как для D. florida, так и для H. digitata до 7,8% для Craniella) микробиома (Рисунок 5A). ASV, уникальные для отдельных особей, представляли относительно высокую долю микробиома для Craniella, H. digitata и Weberella со значениями 19,3, 23,8 и 45% соответственно (Рисунок 5A). У D. florida ни одна из ASV не была видоспецифичной. Результаты на уровне родов были относительно схожи. Действительно, очень мало родов были общими для всех экземпляров (Рисунок 5B). К общим относились Nitrospira, PAUC26f, Sva0996 и Spirochaeta у Craniella, Endozoicomonas у D. florida и Maribacter, Nitrosomonas и Phycisphaera у H. digitata. Мало родов также присутствовало в большинстве (75%) экземпляров (от 1,3% у Weberella до 14,4% у Craniella), в то время как высокая доля уникальных таксонов была обнаружена в каждом эпибентическом таксоне макрофауны (17,7, 23,7 и 33,9% для H. digitata, Craniella и Weberella соответственно; Рисунок 5B).

Рисунок 5 Процент ASV (A) и родов (B) на эпибентический вид, которые были обнаружены как уникальные для или общие для всех экземпляров (100%), большинства экземпляров (75%), половины экземпляров (50%) или как минимум 2 экземпляров.

Интересно, что большинство бактериальных родов, обнаруженных в таксонах бентосной макрофауны, также были обнаружены в окружающей бентической среде, причем в большей степени во флоке, чем в образцах осадка (Таблица 2).

Таблица 2 Средний процент общих бактериальных родов между эпибентическими таксонами макрофауны с образцами осадка и флока.

3.3.2 Функциональный состав микробиома

Образцы H. digitata содержали несколько микробных метаболических путей, не обнаруженных у других эпибентических таксонов (Рисунок 4). Они включали биосинтез 5-гидроксибензимидазола, пути спасения аденина и аденозина II, биосинтез альфа-диглюкозилдиацилглицерина, деградацию лактозы и галактозы I и биосинтез стафилопина. Craniella и D. florida обладали по одной уникальной микробной функции — деградация галлата I и бета-окисление жирных кислот соответственно, в то время как ни одной уникальной функции для Weberella обнаружено не было.

3.3.3 Генетические свойства микробиома

Что касается генетических свойств, микробиом Weberella имел тенденцию к большему числу копий генов 16S рРНК, генетических элементов и кодирующих последовательностей, а также более крупным геномам среди эпибентических таксонов (Рисунок S7). Напротив, микробиом образцов Craniella показывал наименьшее число копий генов 16S рРНК, генетических элементов и имел тенденцию к относительно низкому числу кодирующих последовательностей и небольшому размеру генома, обладая при этом относительно высокой долей GC-связей. Пластичность генома микробиома была схожей между таксонами, но заметно выше у образцов D. florida. Для сравнения, бактериальные сообщества в осадке имели тенденцию к большему числу кодирующих элементов и более крупным геномам, чем у хозяев (Рисунок S7). Ни одно из генетических свойств не показало значимой связи с расстоянием от деятельности рыбоводных ферм (данные не показаны).

3.3.4 Микробное разнообразие

Таксономическое (ASV) и функциональное (EC) микробное богатство среди эпибентических таксонов было самым высоким у H. digitata, за которой следовали Craniella, D. florida и Weberella (Рисунки 4 и 6). По сравнению с бактериальными сообществами, обнаруженными на окружающем морском дне [из образцов осадка и осевшего органического вещества (флока) в Keeley et al. (2021)], микробиомы хозяев были как минимум на порядок ниже по богатству (Рисунок 6). Ни таксономическое, ни функциональное микробное богатство (Таблицы S4 и S5) не показали значимого влияния деятельности рыбоводных ферм.

Рисунок 6 Ящичковые диаграммы бактериального таксономического (ASV) и функционального (EC) богатства по эпибентическим таксонам и образцам морского дна (осадок и флок) с попарными результатами критерия Манна-Уитни-Уилкоксона. Ось Y функционального богатства обрезана для лучшей визуализации значений между таксонами и образцами морского дна. Значимые различия между таксонами проверялись с помощью дисперсионного анализа и отображены над ящичковыми диаграммами. ns — незначимо, = 0,05 > скорр. p.value ≥ 0,01, = 0,01 > скорр. p.value ≥ 1e-3, = 1e-3 > скорр. p.value ≥ 1e-4, = 1e-4 > скорр. p.value ≥ 1e-5.

Что касается бета-разнообразия, сильные и значимые различия наблюдались между эпибентическими таксонами для всех типов данных (Рисунок 7, Таблицы 3 и S6, S7, S8 Дополнительного файла 1). Интересно, что таксономическое микробное сообщество Craniella кластеризовалось в две различные группы, в то время как на основе функций или генетических свойств оно формировало только одну группу (Рисунок 7).

Рисунок 7 Анализ главных компонент бактериального таксономического (A) и функционального (B) разнообразия эпибентических таксонов и генетических свойств микробиома (C).

Таблица 3 Перестановочный дисперсионный анализ (PERMANOVA) по набору данных и таксонам с корнем 4-й степени из расстояния от садка в качестве фактора.

Значимые связи (p.value <= 0,05) выделены жирным шрифтом. ASV — варианты ампликонных последовательностей; EC — номера Комиссии по ферментам.

3.3.5 Влияние рыбоводной фермы на микробиомы

Аквакультурная деятельность оказывала видоспецифичное влияние на бета-разнообразие микробиоты (Рисунок 7 и Таблица 3). В частности, значимое влияние рыбоводства наблюдалось на таксономический (R = 0,11, p.value < 0,001) и функциональный (R = 0,10, p.value = 0,02) профили микробиома H. digitata, а также на функциональные профили микробиома D. florida (R = 0,10, p.value = 0,02) и Craniella (R = 0,05, p.value = 0,02) (Таблица 4). Значимых различий в дисперсии внутри групп по расстоянию от фермы не наблюдалось (анализ betadisper: p = 0,47 и 0,07 для ASV и EC соответственно), но общая дисперсия была обычно выше в таксономическом (ASV) микробном профиле (Рисунок S9).

Таблица 4 Перестановочный дисперсионный анализ (PERMANOVA) таксономического и функционального бета-разнообразия микробиома по эпибентическим видам в зависимости от расстояния от фермы, преобразованного в корень 4-й степени.

Значимые связи (p.value <= 0,05) выделены жирным шрифтом.

Немного бактериальных таксонов значимо ассоциировались с расстоянием от садка. Среди тех, которые, по-видимому, положительно влиялись деятельностью рыбоводной фермы, были ASV, принадлежащие к Psychromonas (Craniella), Endozoicomonas (D. florida), Polaribacter, Colwellia, Kordiimonas, Acanthopleuribacter и Cycloclasticus (H. digitata) и Sedimentitalea (Weberella) (Рисунок 8). Отрицательно связанные с рыбоводством включали Mycoplasma и Candidatus Hepatoplasma (D. florida), Ulvibacter и Aurantivirga (H. digitata), а также Ekhida и Endozoicomonas (Weberella) (Рисунок 8). ASV, принадлежащая к роду Mycoplasma, была единственной, идентифицированной как потенциально патогенная в базе данных ABSA. К сожалению, ее видовая принадлежность не могла быть установлена с использованием баз данных SILVA или NCBI nt (O’Leary et al., 2016).

Рисунок 8 Изменение log2 относительной численности бактериальных ASV на вид, значимо связанных с расстоянием от садка. Бактериальные таксоны с положительными значениями log2 были более обильны на референсных участках и наоборот. Встречаемость каждого бактериального таксона обозначена черными точками. Проценты после названий бактериальных родов указывают процент ASV внутри этого рода, реагирующих на градиент расстояния от рыбоводной фермы.

Что касается метаболических функций на основе базы данных EC, как D. florida, так и Weberella имели пути, значимо связанные с градиентом воздействия (Рисунок S9). Они были в основном отрицательно затронуты и включали функции, ответственные за биосинтез кобамида, деградацию альгината, биосинтез кадаверина, хондроитинсульфат и биосинтез полиненасыщенных длинноцепочечных и сверхдлинноцепочечных жирных кислот (ПНЖК) у D. florida, а также деградацию таурина и фиксацию азота у Weberella (Рисунок S9). Аналогичный анализ, выполненный на базе данных KO, идентифицировал пути для всех эпибентических таксонов, кроме H. digitata (Рисунок S10). Опять же, большинство путей были отрицательно связаны с рыбоводством, с функциями, в первую очередь ответственными за биосинтез факторов вирулентности и липополисахаридов у Craniella, за устойчивость к противомикробным препаратам, белки плотной адгезии, нитритредуктазу и тетратионатредуктазу (метаболизм серы) у D. florida и за белки, индуцируемые повреждением ДНК, и белок секреции типа III у Weberella (Рисунок S11). Функции, которые были значительно выше вблизи садка, включали лизин-N6-гидроксилазу, D-глицеро-альфа-D-манно-гептозо-1-фосфат-гуанилилтрансферазу и GDP/UDP-N,N'-диацетилбациллозамин-2-эпимеразу (гидролизующую) у Craniella, а также белок секреции типа VI и один путь, участвующий в устойчивости к противомикробным препаратам, у Weberella (Рисунок S11).

3.4 Профили жирных кислот и стабильных изотопов эпибентических видов

Профили жирных кислот существенно различались между эпибентическими таксонами (Рисунок 9 и Таблицы S9.1-9.4 Дополнительного файла 1), причем наибольшее разнообразие ЖК обнаружено у Craniella (106), за которой следовали Weberella (87), H. digitata (86) и D. florida (80). Образцы Craniella имели самую высокую долю уникальных ЖК (77%), в то время как большинство ЖК H. digitata (92%) были обнаружены у других таксонов (Рисунок 9). Особенно, большинство ЖК H. digitata (88%) были обнаружены в образцах D. florida.

Рисунок 9 Диаграмма Венна общих жирных кислот (ЖК) между эпибентическими таксонами.

Образцы Craniella демонстрировали чрезвычайно сложные профили, доминируемые насыщенными ЖК (НЖК) [≈ 65% от общих ЖК и с обилием разветвленных изомеров (> 50% от общих ЖК)]. Мононенасыщенные ЖК (МНЖК) составляли 17% от общих ЖК с относительно высокими уровнями 16:1 (n-7) и 18:1 (n-7) (4-5%). Полиненасыщенные ЖК (ПНЖК) (20-26% от общих ЖК) были доминируемы длинноцепочечными нон-метилен-прерванными (НМП) ПНЖК (C26-C28). Образцы Craniella также были очень богаты бактериальными ТМЖК (≈ 50% от общих ЖК), и высокая сложность их профиля ЖК иллюстрируется тем фактом, что 10 доминирующих ЖК составляли только 44-45% от их общих ЖК (Таблица S9.1). У Weberella образцы характеризовались высоким содержанием МНЖК (34-37% от общих ЖК) и (НМП) ПНЖК (38-41% от общих ЖК), причем 10 наиболее важных ЖК представляли 60% от общего количества ЖК (Таблица S9.2). Образцы Weberella также показали очень высокие уровни демоспонгиевых ТМЖК (≈ 40% от общих ЖК). У D. florida профиль ЖК доминировался несколькими ЖК, причем 10 наиболее обильных составляли более 70% от общего профиля. Примечательно, что ПНЖК содержали высокие уровни (n-6) ПНЖК: 20:4 (n-6) и 24:5 (n-6) (15-21% и 11-17% от общих ЖК соответственно) (Таблица S9.3). Морская актиния H. digitata содержала высокую концентрацию восковых эфиров, и ЖС составляли 31-42% от общего количества ЖК. Профиль ЖС показывал большое количество длинноцепочечных мононенасыщенных ЖС (20:1 и 22:1 ЖС) и МЭЖК с высоким содержанием МНЖК [20:1 (n-9) и 22:1 (n-11)] и (n-3) ПНЖК (20:5 (n-3) и 22:6 (n-3) (Таблица S9.4). Длинноцепочечные МНЖК являются типичными ТМЖК калянусов.

Общее количество жирных кислот в мкг на 100 мкг влажного веса также существенно различалось между таксонами и было самым высоким в образцах H. digitata (среднее = 3,08), за которыми следовали Weberella (среднее = 0,57), Craniella (среднее = 0,48) и D. florida (среднее = 0,46).

Анализ PCA и PERMANOVA подтвердил, что профили ЖК существенно различались между таксонами (R² = 0,94), причем влияние деятельности рыбоводной фермы было видоспецифичным (Рисунок 10). В частности, профили ЖК значимо изменялись по корню 4-й степени из расстояния от фермы для всех таксонов, кроме Craniella, с R² в диапазоне от 0,32 (D. florida) до 0,11 (Weberella) (Рисунок 11). Интересно, что губки кластеризовались ближе друг к другу по сравнению с другими таксонами (Рисунок 10).

Рисунок 10 Анализ главных компонент профилей жирных кислот, окрашенных по эпибентическим таксонам и сгруппированных по расстоянию от рыбоводной фермы. Результат перестановочного дисперсионного анализа (PERMANOVA; 9999 перестановок), проверяющего различия между таксонами и влияние корня 4-й степени из расстояния от фермы, отображен в правом нижнем углу, значимые связи (p.value <= 0,05) выделены жирным шрифтом.

Рисунок 11 Анализ избыточности (RDA) профилей жирных кислот по эпибентическим видам с использованием корня 4-й степени из расстояния от фермы в качестве объясняющей переменной. Пять наиболее важных переменных ответа (жирные кислоты) наложены красными стрелками с оттенком, соответствующим их вкладу. Переменные, представляющие особый интерес, включая расстояние от фермы, также были подогнаны (синие стрелки) с использованием функции «envfit» пакета «vegan» в R. Отображены только пять переменных, наиболее коррелирующих с ординацией. Результаты перестановочного дисперсионного анализа (PERMANOVA; 9999 перестановок), проверяющего влияние корня 4-й степени из расстояния от фермы, отображены в правом верхнем углу каждой панели, значимые связи выделены жирным шрифтом.

D. florida был единственным таксоном, показавшим значимые изменения в общих ЖК на мкг влажного веса и беззольного сухого веса по градиенту расстояния от фермы, постепенно увеличиваясь с удалением от деятельности (Рисунок S12). Более высокие уровни (n-6)-ПНЖК, НЖК, бактериальных и хлорофилльных ЖК и более низкие уровни (n-3)-ПНЖК, МНЖК, наземных и динофлагеллятных ЖК также наблюдались у образцов D. florida, расположенных под фермой, по сравнению с референсными участками (Рисунок 11 и S13). Напротив, образцы H. digitata показывали повышенный уровень МНЖК, (n-6)-ПНЖК, ПНЖК-НМП и наземных ЖК и сниженную концентрацию НЖК, бактериальных, хлорофилльных и диатомовых ЖК вблизи фермы (Рисунок 11 и S13). Кроме того, 18:2 (n-6) была более обильна вблизи фермы, в то время как 14:0 была более представлена дальше от нее. У Weberella ЖК, положительно связанные с деятельностью рыбоводной фермы, включали 24:1 (n-9) и МНЖК в целом, в то время как 16:1 (n-11), 26:3 НМП-b, (n-3)-ПНЖК и динофлагеллятные ЖК были связаны отрицательно (Рисунок 11 и S13). Образцы Craniella оказались наименее затронутыми деятельностью рыбоводной фермы и в основном показывали повышенные концентрации динофлагеллятных ЖК [18:3 (n-3) и 18:4 (n-3)] вблизи фермы.

3.5 Взаимосвязи между микробиомом и жирными кислотами

Корреляция между профилями жирных кислот и микробиома была высоко значимой и существенно сильнее с функциональным сообществом (r = 0,807), чем с таксономическим сообществом (r = 0,525) (Таблица S10). Интересно, что микробиом и ЖК-состав обеих губок выявили два различных кластера образцов независимо от расстояний до рыбоводной фермы (Рисунок 9), и в обоих случаях образцы, входящие в кластер 1 и 2, в основном были схожи между наборами данных по микробиому и жирным кислотам (Рисунок S14), что предполагает, что изменения в микробиоме сопровождались изменениями в профиле жирных кислот.

3.6 Профили стабильных изотопов эпибентических видов

Что касается стабильных изотопов δ15N (‰) и δ13C (‰), только D. florida показала значимую связь с расстоянием от садка, с уменьшением концентрации как δ15N, так и δ13C и увеличением отношения δ15N/δ13C при удалении от фермы (Рисунок S14).

4.1 Влияние лососеводства на выживаемость и метаболизм организмов-фильтраторов

Разделить эффекты обогащения питательными веществами и заиливания, вызванные аквакультурной деятельностью, сложно, поскольку они индуцируются одним и тем же процессом и связанными с ним биодонными отложениями. Тем не менее, общепризнанно, что обогащение питательными веществами вблизи ферм может вызывать гипоксические или аноксические условия, приводящие к снижению макробентосного богатства и доминированию нескольких толерантных оппортунистических таксонов, включая полихет и нематод (Keeley, 2013; Price et al., 2014). Повышенное заиливание организмов-фильтраторов обычно связано с повышенной смертностью, но метаболический ответ существенно варьирует в литературе с противоречивыми результатами. В ряде исследований сообщалось о снижении дыхательной активности у кораллов и губок (Lohrer et al., 2006; Maldonado et al., 2008; Tompkins-MacDonald и Leys, 2008), в то время как другие не обнаружили эффектов (Cummings et al., 2020) или даже отметили повышенную скорость дыхания у образцов в условиях повышенной седиментации (Dallmeyer et al., 1982; Riegl и Branch, 1995; Philipp и Fabricius, 2003; Bannister et al., 2012). Вредные последствия повышенной мутности и заиливания, как полагают, возникают в основном из-за закупорки водоносной системы у губок или питательного аппарата у кораллов, увеличения энергетических затрат на питание, связанных с необходимостью выработки большего количества слизи для очистки от осадка, и снижения освещенности, затрудняющего фотосинтетическую активность микробов (Erftemeijer et al., 2012; Leys, 2013). Расхождение в ответной реакции между таксономическими группами особенно объясняется различиями в размере, морфологии и физиологических процессах, позволяющих избежать заиливания (Erftemeijer et al., 2012; Leys, 2013; Junjie et al., 2014; Jones et al., 2019). В своих обзорах Erftemeijer et al. (2012) и Leys (2013) обнаружили, что мелкий осадок обычно оказывает большее влияние, чем крупный, что может способствовать различиям в ответных реакциях между исследованиями. Кроме того, сильное заиливание может вызывать физиологическое закрытие организмов и снижение скорости дыхания, в то время как умеренное заиливание может снижать активность накачки из-за закупорки, но увеличивать скорость дыхания из-за необходимости поддерживать более высокую выработку слизи (Leys, 2013; Biggerstaff et al., 2017). Этот бимодальный ответ может дополнительно объяснить некоторые расхождения, наблюдаемые в литературе.

В этом исследовании мы обнаружили постепенную положительную корреляцию выживаемости с расстоянием от фермы для всех эпибентических таксонов и особенно для H. digitata и Weberella spp. Эта общая тенденция предполагает, что сидячие эпибентосные организмы действительно подвергались негативному воздействию изменений окружающей среды, вызванных рыбоводством. Мягкий коралл D. florida также демонстрировал сильное увеличение скорости дыхания вблизи фермы, однако мы нашли мало доказательств изменения потребления кислорода у трех других видов-фильтраторов. Возможно, что относительно сильная гидродинамика в районе исследования (средняя скорость придонных течений 0,086 м·с⁻¹; Dunlop et al., 2021) в некоторой степени смягчила эффекты заиливания, а с ними и серьезность стрессового градиента, связанного с фермой. Тем не менее, эти результаты актуальны, поскольку фауна была намеренно культивирована на участке, который они естественным образом населяют (за пределами зоны влияния фермы) и который, следовательно, соответствует их основным физическим потребностям. Извлечение организмов из их естественной среды обитания и культивирование их в условиях повышенной нагрузки осадками на участке без дисперсии, где их физические потребности не удовлетворялись, дало бы лишь искусственные результаты (стресс на фоне стресса) с ограниченной применимостью к реальной природе.

4.2 Микробиомы

4.2.1 Характеристика

Губки и кораллы известны тем, что содержат особенно плотные и разнообразные микробные сообщества по сравнению с другими животными, вероятно, из-за их простой организации и зависимости от симбионтов для поддержания различных жизненно важных функций (Pita et al., 2016; van Oppen и Blackall, 2019). Считается, что на разнообразие их микробных сообществ влияет несколько факторов, включая генотип хозяина, фенотип, физиологическое состояние (например, жизненный этап, здоровье), присутствие других симбионтов и факторы окружающей среды (Easson и Thacker, 2014; Thomas et al., 2016; Cleary et al., 2019; van Oppen и Blackall, 2019). Соответственно, мы обнаружили важные различия в микробном разнообразии и составе сообществ между каждым таксоном. Мы также обнаружили незначительное перекрытие межи внутривидовых ASV-последовательностей и, несмотря на относительно схожее таксономическое разнообразие в пределах эпибентических таксонов, наблюдали сильные вариации в относительной численности бактериальных групп между образцами, которые не коррелировали с условиями окружающей среды. Эти результаты подтверждают наличие филосимбиоза у губок и кораллов, при котором разнообразие микробиома хозяина отражает филогению хозяина, и предполагают сильное влияние биологических факторов (например, жизненный этап, фенотип), которые не были учтены в этом исследовании.

4.2.2 Микробиом губок HMA и LMA

У губок виды могут существенно различаться по своим прокариотическим ассамбляжам и обычно делятся на две широкие категории: губки с высокой микробной численностью (HMA), также называемые бактероспонгиями, и губки с низкой микробной численностью (LMA), называемые несимбионт-содержащими губками (Hentschel et al., 2003; Hentschel et al., 2012). Губки, принадлежащие к первой группе, обычно доминируются Chloroflexi, Acidobacteria и Actinobacteria (van Soest et al., 2012; Moitinho-Silva et al., 2017), характеризуются более высоким микробным богатством (Weisz et al., 2007) и относительно стабильным консорциумом обогащенных губками микробов (Kamke et al., 2010; Hentschel et al., 2012). Напротив, разнообразие LMA обычно ограничено, сводится к нескольким бактериальным типам, таким как Proteobacteria, Cyanobacteria и Chloroflexi (Weisz et al., 2007; Kamke et al., 2010; Giles et al., 2013; Bayer et al., 2014), тесно связано с бактериями, обнаруженными в окружающей морской воде (Schmitt et al., 2007; Schmitt et al., 2011), с небольшим перекрытием бактериальных таксонов между образцами (Moitinho-Silva et al., 2014). Из-за более высоких внутри- и межвидовых сходств микробиома у HMA-губок также считается, что вертикальная передача (передача бактерий от родителей к потомству) играет более важную роль у HMA-губок, чем у LMA-губок, где горизонтальная передача (приобретение бактерий из окружающей среды) может быть более распространена (Giles et al., 2013; Oliveira et al., 2020). Профили микробиома двух исследованных нами видов губок существенно различались как по таксономическому, так и по функциональному разнообразию: Craniella содержала больше типов и более чем в три раза больше ASV и EC, чем Weberella. Немногие виды Craniella были идентифицированы как HMA-губки (Schöttner et al., 2013; Anbuchezhian и Li, 2015), но никакой предшествующей информации не было получено для Weberella. Хотя мы не проводили количественного анализа микробной плотности, наши результаты позволяют предположить, что Weberella относится к LMA-губкам, с важным доминированием Proteobacteria и Nitrospinae и значениями богатства, схожими с ранее сообщавшимися для LMA-губок (Giles et al., 2013). Это предположение также подтверждается меньшей долей основных ASV у Weberella и более высоким процентом общих бактериальных родов с образцами осадка и флока, что указывает на более значительную роль горизонтального переноса в приобретении бактерий.

4.2.3 Функциональная способность микробиома

Считается, что бактерии, ассоциированные с кораллами и губками, играют важную роль в питании их хозяев и механизмах химической защиты, способствуя фиксации углерода, метаболизму азота, круговороту серы и производству антимикробных соединений (Thompson et al., 2014; Li, 2019; van Oppen и Blackall, 2019). Таким образом, несмотря на важные различия в таксономическом составе микробиома между таксонами, функциональный микробный профиль обычно сходится у хозяев с обогащением специализированных бактерий по сравнению с окружающей средой (Bayer et al., 2014; Gantt et al., 2019; Fiore et al., 2020). Хотя четкое различие все еще можно было наблюдать между функциональными профилями различных таксонов-фильтраторов, эта конвергенция была продемонстрирована на примере образцов Craniella, которые, по-видимому, были представлены двумя различными видами или подвидами на основе их микробных ASV-сообществ, но не могли быть разделены на основе их микробных функциональных возможностей. Более высокое отношение функционального к таксономическому богатству между свободноживущими сообществами и микробиомами хозяев также подтверждает слияние метаболических путей у хозяев.

4.2.4 Генетические свойства микробиома

Интересно, что каждый эпибентический таксон можно было дифференцировать по общим генетическим свойствам их микробиомов (т.е. среднему числу копий 16S рРНК, среднему размеру генома, среднему содержанию GC, средней пластичности генома, среднему числу кодирующих последовательностей (ncds) и среднему числу генетических элементов). В этом случае средний размер генома и ncds были самыми высокими в образцах морского дна, за которыми следовал микробиом Weberella. Свободноживущие и бактерии-генералисты обычно характеризуются более крупными геномами и большим числом кодирующих последовательностей, чем специализированные, симбиотические, поскольку они обычно выполняют более разнообразный спектр метаболических активностей. Тот факт, что микробиомы Weberella имели значения, близкие к образцам осадка и флока, является еще одним указанием на то, что он может в большей степени полагаться на горизонтальный перенос для приобретения бактерий. У Craniella микробиомы имели тенденцию к повышенному содержанию GC по сравнению с другими таксонами, в то время как микробиом D. florida показывал более высокую пластичность генома. Пары GC связаны тремя водородными связями против двух для аденин-тиминовых (AT), что делает ДНК с высоким содержанием GC более термостабильной (Yakovchuk et al., 2006). Было также обнаружено, что содержание GC у прокариот положительно коррелирует с размером генома (Almpanis et al., 2018), что, за исключением Craniella, можно наблюдать в наших данных. Мутации в геномах прокариот естественным образом смещены в сторону AT-связей (Hershberg и Petrov, 2010; Bohlin et al., 2018), и поэтому считается, что повышенное содержание GC обусловлено усиленным селективным давлением (Raghavan et al., 2012). Хотя факторы, влияющие на содержание GC, все еще обсуждаются, существует консенсус, что вовлечены множественные не взаимоисключающие элементы, связанные как с эволюционной историей, так и с окружающей средой (Mann и Chen, 2010; Almpanis et al., 2018). В частности, есть доказательства связи между содержанием GC и оптимальной температурой роста (Musto et al., 2004; Wang et al., 2006; Zheng и Wu, 2010), положительной корреляции со способностью к фиксации азота (McEwan et al., 1998) и аэробиозом (Naya et al., 2002). Что касается показателя phi, он представляет собой указание на то, насколько «пластичны» геномы и, следовательно, насколько вероятно, что они потеряют или интегрируют новые гены посредством горизонтального переноса (Bowman и Ducklow, 2015). Пластичность генома облегчает адаптацию к новым средам или условиям (Woodcock et al., 2017b) и была связана с повышенной устойчивостью микробов у Vibrio (Verma et al., 2019). Гипотетически, эти различия в генетических свойствах микробиома могут влиять на устойчивость микробиомов и, следовательно, хозяина к изменениям окружающей среды. Дальнейшие исследования в этой области могут дать интересные сведения об устойчивости губок и кораллов к изменению климата в меняющемся океане.

4.2.5 Чувствительность к лососеводству

4.2.5.1 Влияние на микробное разнообразие

В нескольких исследованиях сообщалось о влиянии антропогенной деятельности на микробиомы кораллов и губок (Meron et al., 2011; Morrow et al., 2012; Jessen et al., 2013; Gissi et al., 2019; Ziegler et al., 2019) (но см. Pineda et al., 2017) с доказательствами снижения выравненности и увеличения богатства и бета-разнообразия в условиях стресса (см. обзор McDevitt-Irwin et al., 2017). Действительно, считается, что стресс окружающей среды ослабляет контроль «сверху вниз» в голобионте, вызывая дисбиоз (микробный дисбаланс) и увеличивая распространенность оппортунистических микробов в ущерб полезным (van Oppen и Blackall, 2019). В нашем исследовании мы не обнаружили изменения бактериального богатства из-за рыбоводства, но нашли доказательства видоспецифичного влияния на бета-разнообразие микробиома хозяина. Изменения, связанные с рыбоводством, особенно наблюдались у H. digitata со значительным изменением как таксономических, так и функциональных профилей. Слабое, но значимое влияние на функциональные профили было также обнаружено у других эпибентических таксонов, за исключением Weberella. Стохастичность в составе сообщества обычно была выше для ASV, чем для EC. Таким образом, вероятно, что более низкая чувствительность таксономического профиля связана с тем, что разные, но близкородственные таксоны выполняют эквивалентные метаболические функции, связанные с деятельностью рыбоводной фермы, у образцов с одних и тех же станций.

4.2.5.2 Предполагаемые микробные индикаторы

Немногие ASV были идентифицированы как потенциальные индикаторы органического обогащения, включая Psychromonas у Craniella, несколько ASV Endozoicomonas у D. florida, Polaribacter, Kordiimonas, Acanthopleuribacter, Cycloclasticus и Colwellia у H. digitata и Sedimentitalea у Weberella. В нескольких исследованиях сообщалось об обогащении Colwellia, Polaribacter и Psychromonas в системах марикультуры (Verhoeven et al., 2018; Wang et al., 2018; Molina и Fernández, 2020). Что касается Endozoicomonas, они часто представляют важную часть микробиома морских эукариот (Bayer et al., 2013; Nishijima et al., 2013; Fiore et al., 2015; Ziegler et al., 2016; Bartz et al., 2018), но их функциональная роль остается в значительной степени неизвестной (Neave et al., 2017). У губок и кораллов считается, что они способствуют усвоению питательных веществ и круговороту веществ, играя возрастающую роль в олиготрофных средах (Rossbach et al., 2019). И наоборот, было обнаружено, что Endozoicomonas оказывают вредное воздействие на рыб-хозяев в системах марикультуры, в частности вызывая эпителиоцистоз и индуцируя смертность (Mendoza et al., 2013; Katharios et al., 2015). Здесь несколько членов Endozoicomonas были связаны с рыбоводством у D. florida, но с референсными условиями у Weberella. Эти результаты согласуются с результатами Ziegler et al. (2016), где разные штаммы Endozoicomonas внутри кораллов-хозяев реагировали противоположным образом на антропогенные воздействия, что позволяет предположить, что члены этого семейства могут играть совершенно разные роли у своих эукариотических хозяев.

Многочисленные микробные метаболические функции были обнаружены как значительно коррелирующие с рыбоводством, но немногие положительно связаны с органическим обогащением как таковым. Они включали лизин-N6-гидроксилазу и D-глицеро-альфа-манно-гептозо-1-фосфат-гуанилилтрансферазу у Craniella и белок системы секреции типа VI и функцию устойчивости к противомикробным препаратам у Weberella. Системы секреции типа IV функционируют в первую очередь как межбактериальный антагонизм для борьбы с конкуренцией (García-Bayona и Comstock, 2018). Их повышенное содержание в образцах Weberella в ближней зоне, наряду с путями устойчивости к противомикробным препаратам, может указывать на повышенные усилия голобионта по контролю микробного разнообразия в среде, обогащенной питательными веществами, или на побочный эффект повышенной выработки слизи и связанных с ней антимикробных соединений, производимых резидентами бактериями (Ritchie, 2006; Nissimov et al., 2009). Некоторые пути, отрицательно связанные с рыбоводством, относились к метаболизму питательных веществ и транспорту (например, фиксация азота, окисление сульфита, транспорт и деградация фруктозы и сахарозы). Хотя это наблюдение связано с разницей в концентрации и происхождении питательных веществ между участками у садка и референсными участками, оно контрастирует с результатами Kelly et al. (2014) и Ziegler et al. (2016), где более высокая доступность питательных веществ была связана с повышенным метаболизмом, связанным с питательными веществами. Это несоответствие, возможно, связано с влиянием заиливания вблизи садка, снижающего усвоение питательных веществ как у губок, так и у кораллов из-за препятствования их механизму питания. Тем не менее, эти наблюдения подтверждают гипотезу о том, что структура микробного сообщества частично определяется доступными источниками пищи и потребностями хозяина в питательных веществах.

4.3 Жирные кислоты и стабильные изотопы

4.3.1 Профилирование

Известно, что профили жирных кислот у кораллов и губок являются таксон-специфичными и сильно зависят от их симбионтов и источников питания (Rod’kina, 2005; Imbs et al., 2010; Salvo et al., 2018). Таким образом, они могут быть полезными хемотаксономическими и экологическими биомаркерами (Núñez-Pons et al., 2012; Imbs et al., 2019). Они также использовались как показатель для оценки биомассы микроорганизмов у хозяев-губок (Rod’kina, 2003). В этом исследовании профили жирных кислот были высокоспецифичны для каждого эпибентического таксона, с наибольшим сходством между двумя губками. Образцы Craniella особенно характеризовались наиболее сложными профилями ЖК из всех таксонов и сильным доминированием разветвленных ЖК, вероятно, происходящих из их микробиомов. Это совпадает с высоким бактериальным разнообразием Craniella, примерно в три раза превышающим таковое у Weberella. Напротив, образцы Weberella показывали более простые профили ЖК, в основном доминируемые НМП-ПНЖК (32-40%), МНЖК (35-37%) и НЖК (19-20%). Эти результаты дополнительно подтверждают Craniella как HMA-губку, сильно зависящую от своего микробиома для синтеза ЖК, и Weberella как LMA с меньшим вкладом со стороны ее микробиома. Интересно, что в обоих наборах данных Craniella и Weberella наблюдалась кластеризация образцов в две различные группы, независимо от их местоположения. Кроме того, кластеризованные образцы на основе профилей ЖК в основном совпадали с таковыми на основе микробных профилей хозяина. Это наблюдение предоставляет дополнительные доказательства того, что были отобраны два разных, но близкородственных вида или подвида Craniella и Weberella, и дополнительно подчеркивает ценность ЖК как хемотаксономических индикаторов.

Образцы мягкого коралла D. florida характеризовались значительной концентрацией (n-6)-ПНЖК, особенностью восьмилучевых кораллов (Imbs, 2013). Что касается актинии H. digitata, образцы содержали большую концентрацию восковых эфиров, которые особенно полезны для накопления энергии и обычно обнаруживаются в высоких концентрациях у морских животных, питающихся фито- и зоопланктоном (Dalsgaard et al., 2003). H. digitata также имела особенно высокий общий вес ЖК по сравнению с другими эпибентическими таксонами (до шести раз выше), обладая при этом самым простым профилем ЖК из всех таксонов. Высокие уровни длинноцепочечных МНЖК (20:1 и 22:1) как в ЖС, так и в ЖК позволяют предположить, что рацион морской актинии был в основном сосредоточен на Calanus — распространенном морском копеподе, особенно богатом этими восковыми эфирами (Lee et al., 2006).

В целом, профили жирных кислот были высокоспецифичны для таксонов и сильно коррелировали с микробиомом хозяина и особенно с функциональным микробным сообществом (r≥0,8). Эта сильная ассоциация указывает на значительное влияние метаболических способностей микробиома на структурирование жирных кислот у этих эпибентических организмов.

4.3.2 Чувствительность к лососеводству

Кораллы и губки имеют сильно различающиеся профили ЖК по сравнению с другими морскими животными, и поскольку эти организмы получают большинство своих ЖК от симбионтов и/или из источников питания, они могут быть особенно полезны в качестве экологических биомаркеров, в частности для отслеживания изменений условий окружающей среды (Imbs, 2013; de Kluijver et al., 2021). Являясь основным компонентом общих липидов как у кораллов, так и у губок, жирные кислоты также использовались как мера энергетических резервов и для оценки потенциальной устойчивости таксонов к стрессу (Imbs и Yakovleva, 2012; Bennett et al., 2018). В нашем исследовании только D. florida показала значимую связь между нормализованным общим весом ЖК и рыбоводством, демонстрируя сниженное количество вблизи садка. Интересно, что D. florida был также единственным эпибентическим таксоном, показавшим значительное увеличение скорости дыхания вблизи фермы, и имел самую низкую выживаемость. Это позволяет предположить, что образцы D. florida, расположенные вблизи фермы, могли быть особенно активны в очистке своего питательного аппарата от заиливания, что в сочетании с потенциально сниженным потреблением питательных веществ могло привести к уменьшению запасов липидов и устойчивости.

Рассматривая влияние деятельности рыбоводной фермы на общие профили ЖК, D. florida оказался наиболее чувствительным таксоном, за которым следовали H. digitata и Weberella. В частности, образцы D. florida, расположенные под фермой, демонстрировали сниженную концентрацию (n-3)-ПНЖК и МНЖК, но повышенную концентрацию (n-6)-ПНЖК по сравнению с референсными условиями. В то время как Weberella также показывала снижение (n-3)-ПНЖК в условиях фермы, как Weberella, так и H. digitata демонстрировали повышенную концентрацию МНЖК у садка. Считается, что омега-3 и омега-6 ПНЖК обеспечивают повышенную устойчивость к стрессу у ряда таксонов, и истощение этих ПНЖК у губок и кораллов было связано с ухудшением здоровья и повышенной заболеваемостью и смертностью (Bachok et al., 2006; Bennett et al., 2018). Что касается МНЖК, они представляют собой легко доступный источник энергии (Tocher, 2003), и было обнаружено, что они снижаются у губок, подвергшихся стрессу, для компенсации энергетического дефицита (Bennett et al., 2018). Предполагаемые трудности с питанием, испытываемые образцами D. florida в условиях фермы, могли индуцировать катаболизм МНЖК и (n-3)-ПНЖК и объяснять более низкие концентрации, обнаруженные у этих организмов. Напротив, образцы H. digitata и Weberella не демонстрировали признаков нарушения питания и, возможно, адаптировали другую стратегию к повышенной скорости седиментации, например, повышение метаболизма МНЖК.

Корма для лосося в основном производятся из наземных растений, содержащих высокую концентрацию наземных жирных кислот и стабильных изотопов δ13C и δ15N, которые успешно использовались как показатель деятельности рыбоводных ферм в осадках (White et al., 2019; Woodcock et al., 2019). Таким образом, мы ожидали, что наземные ЖК и стабильный изотоп δ13C станут более заметными у губок и кораллов, расположенных вблизи садка, в то время как δ15N уменьшится. Однако только H. digitata показала значительное увеличение наземных ЖК вблизи рыбоводной фермы, в то время как D. florida демонстрировала противоположный ответ. Возможно, что это контрастное наблюдение у D. florida было вызвано закупоркой ее питательного аппарата вблизи фермы и, следовательно, ее способности усваивать органический материал. Однако мы также признаем, что профиль жирных кислот корма не был выполнен в этом исследовании и, возможно, не был в такой степени доминируем наземными жирными кислотами, как предполагалось.

Что касается стабильных изотопов, только D. florida показала значимую связь δ13C и δ15N с деятельностью фермы. В совокупности профили жирных кислот и стабильных изотопов указывают на то, что целенаправленное использование наземных ЖК и стабильных изотопов в тканях эпибентических сидячих организмов может не представлять собой чувствительный метод для обнаружения воздействия рыбоводства и может лучше оцениваться через общий оборот профиля ЖК.

В целом, наши результаты указывают на то, что рыбоводство действительно влияет на сидячих эпибентосных организмов-фильтраторов, но эти воздействия специфичны для каждой таксономической группы. Мы обнаружили, что воздействие рыбоводства, включая органическое обогащение и заиливание, было связано с повышенной смертностью эпифауны, но, за исключением D. florida, практически не влияло на скорость дыхания. Хотя это предполагает, что уровень смертности перемещенной эпифауны может использоваться как показатель градиента воздействия, обнаружение ранних признаков ухудшения здоровья имеет жизненно важное значение для вмешательства до того, как будет нанесен непоправимый ущерб. В этом исследовании мы нашли доказательства измененных функциональных микробных и жирнокислотных профилей у эпифауны, связанных с деятельностью ферм, но также и то, что степень реакции была видоспецифичной, особенно затрагивая H. digitata и D. florida. Мы также идентифицировали несколько микробных таксонов и функций, а также ЖК, которые значимо ассоциировались с градиентом воздействия и которые, после дальнейшей валидации исследований, могли бы служить показателями здоровья бентоса для мониторинга условий на смешанных и твердых субстратах, где традиционные методы мониторинга неприменимы. Будущие исследования должны быть направлены на лучшее понимание основных механизмов, вызывающих изменения микробиома и ЖК, с использованием комбинации омиксных подходов (например, метагеномики и метатранскриптомики) и подтверждение связей, установленных между идентифицированными предполагаемыми индикаторами и градиентом воздействия, исходящим от рыбоводства.

Дополнительный материал к этой статье можно найти онлайн по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmars.2022.841806/full#supplementary-material

Laroche O, Meier S, Mjøs SA and Keeley N (2022) Suspension-Feeding Benthic Species’ Physiological and Microbiome Response to Salmon Farming and Associated Environmental Changes. Front. Mar. Sci. 9:841806. doi: 10.3389/fmars.2022.841806

Перевод статьи «Suspension-Feeding Benthic Species’ Physiological and Microbiome Response to Salmon Farming and Associated Environmental Changes» авторов Laroche O, Meier S, Mjøs SA and Keeley N., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык