Опубликовано через 42 минуты

Три схемы синхронизации эструса у коз: какая выгоднее для фермы

Целью данного исследования было оценить эффективность протоколов синхронизации эструса у коз и определить наиболее экономически эффективную схему для интенсивного животноводства. В оцениваемых протоколах использовались прогестероновые (P4) губки или устройства CIDR (контролируемое внутреннее высвобождение лекарственных веществ) в сочетании с сывороткой жерёбых кобыл (СЖК / PMSG) и простагландином (ПГ / PG) — для индукции эструса и наступления беременности у коз, а также для определения наиболее экономически эффективной схемы для интенсивного козоводства.

В течение как сезона размножения, так и вне сезона размножения козам назначали следующие варианты лечения: Группа I (P4 губка + PMSG), Группа II (P4 губка + PMSG + PG) и Группа III (CIDR + PMSG + PG). Мы измеряли реакцию эструса после удаления устройства и оценивали показатели беременности после искусственного осеменения (ИО), а также анализировали динамику сывороточных гормонов. Кроме того, были рассчитаны затраты на медикаменты для каждого протокола. Для наиболее эффективного протокола мы также определяли время овуляции и проводили лапароскопически ассистированное ИО. Наступление эструса происходило раньше в группах II и III, чем в группе I, в течение обоих сезонов испытаний. Тем не менее общие показатели эструса и беременности существенно не различались между группами (P > 0,05), при этом в группе II наблюдался самый низкий показатель беременности. Затраты на медикаменты на одну козу и на одну беременность были наименьшими в группе I. В рамках протокола группы I овуляция происходила через 32 ч после наступления эструса, а лапароскопически ассистированное ИО дало значительно более высокий показатель беременности со свежей спермой, чем с охлаждённой спермой (P < 0,05). Концентрация эстрадиола (E2) в сыворотке крови в момент наступления эструса была значительно выше в группе I, чем в группе II (P < 0,05), а уровни лютеинизирующего гормона (ЛГ) в момент наступления эструса и овуляции были значительно выше в группах I и III, чем в группе II (P < 0,05). Профили P4, ЛГ и E2 в сыворотке крови в течение полового цикла следовали сходным закономерностям во всех группах. В заключение, не было значительных различий в показателях беременности между тремя протоколами синхронизации эструса. Однако протокол I продемонстрировал наименьшие затраты на медикаменты на одну козу и на одну беременность. Исходя из соображений экономической эффективности, протокол P4 губка + PMSG рекомендуется для использования в системах интенсивного козоводства.

Козоводство является важной экономической деятельностью, смещающейся от мелкомасштабных децентрализованных хозяйств к интенсивным крупномасштабным системам для удовлетворения растущего рыночного спроса на мясо и пух (1). Однако зависимость от естественного эструса и спаривания у маток удлиняет интервал между окотами, снижая доходы хозяйства и увеличивая затраты. Поэтому повышение показателей воспроизводства маточного поголовья является ключевой целью для племенных хозяйств (2). Синхронизация эструса представляет собой эффективный способ повышения эффективности воспроизводства у мелких жвачных. Этот метод использует экзогенные гормоны для индукции синхронизированного эструса, позволяет проводить синхронизированное искусственное осеменение (ИО) и концентрированный окот, а также сокращает интервал генерации стада и интервалы между эструсами. В конечном счёте он поддерживает партийное управление и снижает затраты труда и финансовых ресурсов (3). Коза Шаньбэйская белая пуховая (SBWC) — основная порода двойного назначения для производства пуха и мяса на северо-западе провинции Шэньси, Китай (4), — сталкивается с ограничениями из-за сезонного эструса и преобладания одноплодного окота. Применение синхронизации эструса и ИО у коз Шаньбэйской белой пуховой породы позволяет синхронизировать окот и упростить управление. Этот подход также снижает потребность в козлах-производителях, продлевает их продуктивную жизнь и снижает общие затраты на выращивание (5).

Современные протоколы синхронизации эструса у жвачных часто используют пропитанные прогестероном вагинальные губки или устройства контролируемого внутреннего высвобождения лекарственных средств (CIDR), часто в сочетании с простагландином (PG), сывороткой жерёбых кобыл (PMSG) и человеческим хорионическим гонадотропином (HCG) (6). Физиологическая основа синхронизации эструса включает использование экзогенных гормонов для вмешательства в регуляторный баланс гипоталамо-гипофизарно-яичниковой (HPO) оси, тем самым выравнивая развитие фолликулов и наступление эструса в группе животных (7). Основными применяемыми прогестагенами являются прогестерон (P4), фторгестон ацетат (FGA) и медроксипрогестерон ацетат (MAP), причём P4 служит основным компонентом в большинстве вагинальных губок и устройств CIDR (8). Его основной механизм — отрицательная обратная связь, которая подавляет импульсы гонадотропин-рилизинг гормона (GnRH) гипоталамуса, тем самым снижая секрецию фолликулостимулирующего гормона (FSH) и лютеинизирующего гормона (LH) гипофиза (9). Это приводит к атрезии доминантных фолликулов и блокирует рост новых гетерогенных фолликулов. После отмены прогестагена отрицательная обратная связь снимается, секреция GnRH возобновляется, а синхронизированное высвобождение FSH и LH запускает единую волну развития фолликулов (10). Следовательно, продолжительность введения прогестагена напрямую влияет на эффективность синхронизации. Исследования показали, что среднесрочные и долгосрочные протоколы синхронизации с использованием пропитанных P4 губок или устройств CIDR обычно дают лучшие результаты, чем краткосрочные протоколы. Овцематки, получавшие CIDR и PMSG в течение 14 дней, демонстрировали значительно более раннее наступление эструса по сравнению с теми, кого обрабатывали 6–7 дней, а также более высокие показатели эструса и окота (11, 12). Эта польза, вероятно, обусловлена более полной элиминацией развития гетерогенных фолликулов во время длительной обработки прогестероном, что способствует более плотному синхронному рекрутированию новой волны фолликулов под контролем HPO оси (13). Мета-анализы показывают, что CIDR и вагинальные губки одинаково эффективны для индукции эструса у маток в различных климатических условиях и сезонах, хотя CIDR часто обеспечивают превосходную синхронизацию. Однако время наступления эструса остаётся непостоянным: некоторые исследования сообщают о более коротком интервале с губками, в то время как другие обнаруживают более раннее наступление с CIDR (14). Эти расхождения, вероятно, отражают различия в породе, сезоне или обращении. Кроме того, вагинальные губки чаще, чем силиконовые устройства CIDR, вызывают гнойные или геморрагические выделения; совместное применение антибиотиков оказалось эффективным для предотвращения вагинита (15).

Основываясь на фолликулярной синхронизации, установленной прогестероном, PMSG и PG дополнительно регулируют развитие фолликулов и инициацию эструса, воздействуя на функцию яичников ниже по HPO оси (16). PMSG, обладая двойной активностью FSH и LH, обычно используется для синхронизации эструса и индукции суперовуляции. После отмены прогестерона PMSG действует совместно с эндогенными гонадотропинами, стимулируя синхронизированный рост рекрутированных фолликулов, ускоряя пролиферацию гранулёзных клеток и синтез эстрогена (17, 18). Его LH-подобная активность также стимулирует продукцию андрогенов клетками теки, обеспечивая предшественник для эстрогена и дополнительно стимулируя развитие фолликулов. Это координированное действие помогает обеспечить одновременное созревание нескольких фолликулов, улучшая синхронизацию эструса (19, 20). Напротив, PG действует путём регрессии жёлтого тела, вызывая быстрое падение P4 (21). Это устраняет опосредованную P4 отрицательную обратную связь на HPO оси, запуская высвобождение GnRH и гонадотропинов для инициации эструса (22). Хотя PG прост в применении, он в одиночку менее надёжен для осеменения в фиксированное время, поскольку стадия полового цикла, а следовательно, и статус жёлтого тела, различаются среди овцематок, что приводит к плохой однородности эструса (23). Поэтому PG обычно комбинируют с предшествующей обработкой P4. P4 сначала синхронизирует волны фолликулов и стандартизирует развитие жёлтого тела, затем PG вводится для индукции синхронизированного лизиса жёлтого тела, что приводит к плотно синхронизированному эструсу (24).

Помимо PG и PMSG, GnRH и HCG также являются важными гормонами, используемыми для синхронизации эструса у жвачных. CIDR в сочетании с PMSG и HCG, например, может повысить долю ягнят, рождённых в первые 10 дней, и общий показатель окота (25). Это может быть связано с LH-подобной активностью HCG, которая поддерживает пост-овуляторную трансформацию стенки фолликула в функциональное жёлтое тело, усиливая секрецию прогестерона и потенциально способствуя имплантации эмбриона (26). В отличие от PMSG, экзогенное введение GnRH мощно стимулирует переднюю долю гипофиза к высвобождению LH и FSH пульсирующим образом. Он действует главным образом путём имитации эндогенного пика LH для запуска разрыва и овуляции зрелых доминантных фолликулов, функционируя скорее как индуктор овуляции, чем как агент синхронизации фолликулов (27). По сравнению с протоколами CIDR-PMSG, обработка CIDR-GnRH у овцематок незначительно изменяет уровни прогестерона в плазме, показатели эструса или беременности, но приводит к меньшему числу жёлтых тел и более низкой частоте овуляции, и этот результат может быть связан с тем, что GnRH задерживает наступление эструса и сокращает его продолжительность (28, 29).

В данном исследовании сравнивалась эффективность трёх протоколов синхронизации: Группа I (P4 губка + PMSG), Группа II (P4 губка + PMSG + PG) и Группа III (CIDR + PMSG + PG) — для балансировки эффективности и стоимости в воспроизводстве коз. Здесь P4 губка и устройства CIDR являются наиболее распространёнными источниками экзогенного прогестерона: губки недороги, тогда как CIDR проще в обращении, обеспечивают более стабильное высвобождение гормона и, вероятно, вызывают меньше раздражения у животных. Сообщалось, что высокие дозы PMSG могут сокращать эструс и снижать эмбриональный потенциал; 200–300 МЕ достаточно для успешного осеменения в фиксированное время у коз (30). Поэтому была выбрана доза 250 МЕ PMSG. PG эффективно лизирует функциональные жёлтые тела; в литературе рекомендуется доза 0,05–0,1 мг (31, 32). Для обеспечения полной регрессии жёлтого тела в Группах II и III вводилась более высокая доза 0,1 мг PG с целью оценки его комбинированного эффекта с PMSG для оптимизации синхронизации волн фолликулов и концентрации эструса. Высокая синхронность эструса после обработки также облегчает применение ИО. Методы ИО включают глубокое вагинальное, цервикальное и лапароскопическое. В отличие от вагинального или цервикального методов, лапароскопическое ИО вводит сперму непосредственно в рог матки или яйцевод, сокращая расстояние и энергию, необходимые для взаимодействия сперматозоидов и ооцитов (33). Этот метод, однако, требует точного прогнозирования времени овуляции. В настоящее время нет исследований, сообщающих о времени овуляции у коз Шаньбэйской белой пуховой породы после синхронизированного эструса. В системах разведения коз эффективное использование генетических ресурсов элитных козлов-производителей имеет важное значение для ускорения генетического прогресса. Свежая сперма, представляющая оптимальное биологическое состояние, предпочтительна для максимизации вклада превосходных производителей. Для преодоления географических ограничений необходимо сохранение спермы путём охлаждения или замораживания для транспортировки на большие расстояния. Однако замороженно-оттаянная сперма подвержена повреждению от избыточных активных форм кислорода (ROS) и перекисного окисления липидов (LPO), которые ухудшают качество спермы и показатели оплодотворения. Напротив, охлаждённая сперма облегчает как межрегиональное распределение, так и поддержание высокого качества спермы (34).

Основываясь на предыдущих исследованиях, мы предположили, что (1) тип прогестеронового устройства не влияет на эффективность синхронизации эструса при использовании с PMSG отдельно или в комбинации с PG; (2) включение PG вызовет более раннее наступление эструса по сравнению с PMSG отдельно; (3) и при оптимальном протоколе лапароскопическое осеменение свежей спермой даст более высокий показатель беременности, чем охлаждённой спермой. Целью данного исследования было определить подходящий протокол синхронизации эструса для интенсивного козоводства путём сравнения эффективности и затрат на вводимые ресурсы трёх протоколов, а также путём оценки связанной динамики репродуктивных гормонов, тем самым способствуя оптимизации системы разведения коз Шаньбэйской белой пуховой породы.

2.1 Экспериментальные животные

Данное исследование проводилось в сезон размножения (с августа по октябрь) и вне сезона размножения (с апреля по июнь) на интенсивной козоводческой ферме в городе Юйлинь, провинция Шэньси, Китай. Экспериментальные козы отбирались методом таблицы случайных чисел. Процедура была следующей. В сезон размножения и вне сезона размножения было отобрано 165 и 157 самок коз Шаньбэйской белой пуховой породы в возрасте 2–4 лет с массой тела 40–50 кг соответственно. Все отобранные матки имели историю окота. Животные были случайным образом разделены на три группы, каждая из которых содержала не менее 45 особей. Затем каждой козе был присвоен уникальный последовательный идентификационный номер. Соответствующие значения из таблицы случайных чисел были последовательно сопоставлены с этими номерами. Согласно величине этих значений животные циклически распределялись в Группу I, II и III. Итоговые размеры групп составили 49, 57 и 59 коз для сезона размножения и 57, 53 и 47 коз для вне сезона размножения. Каждая группа подвергалась различному протоколу синхронизации эструса. В течение сезона размножения было дополнительно случайным образом отобрано 69 самок коз Шаньбэйской белой пуховой породы также в возрасте 2–4 лет и массой 40–50 кг. Используя тот же метод таблицы случайных чисел, их распределили на две группы по 39 и 30 коз соответственно. Эти группы затем получали протокол синхронизации эструса, признанный наиболее эффективным и экономически выгодным, и их показатели овуляции наблюдались и регистрировались. Сперма была собрана от 8 козлов Шаньбэйской белой пуховой породы в возрасте 2–4 лет и массой 60–70 кг. Все козлы имели предыдущий опыт сбора спермы, успешно производили потомство путём искусственного осеменения и демонстрировали сильное либидо.

Все козы содержались и кормились в идентичных условиях, и их кормили дважды в день в 08:00 и 16:00, с водой без ограничений. Козлы также получали ежедневную добавку в виде одного свежего яйца.

2.2 Статистическое обоснование численности экспериментальных животных

Априорный анализ мощности был проведён с использованием GPower (v.3.1.9.7, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Дюссельдорф, Германия) с дополнительным подтверждением методом уравнения ресурсов в SPSS (v.21.0, SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Параметры настройки были установлены на основе общих стандартов экспериментов на животных и соответствующей литературы (35, 36): статистическая мощность (1-β) = 0,8, уровень значимости (α) = 0,05 и средний размер эффекта (w Коэна = 0,3). Рассчитанный размер выборки был увеличен на 5%−10% для учёта потенциальных потерь, таких как потери из-за аномального эструса.

Для эксперимента по сравнению протоколов синхронизации эструса минимальный размер выборки на группу для дихотомического исхода по показателям эструса и беременности был рассчитан с использованием критерия хи-квадрат. Исходя из ожидаемого показателя эструса 0,8 и минимального обнаруживаемого различия 0,15, требуемый размер выборки составил 36 маток на группу. Наименьший фактический размер группы составил 47 маток, что превышает этот минимум. Размеры групп были хорошо сбалансированы (вариация ≤ 7%). Метод уравнения ресурсов дал степени свободы ошибки 161 (сезон размножения) и 153 (вне сезона размножения), оба существенно выше рекомендуемого порога 10 (37), что указывает на устойчивость к индивидуальной изменчивости.

Для эксперимента по лапароскопическому ИО требуемый размер выборки на группу для сравнения показателей беременности был рассчитан с использованием критерия хи-квадрат для двух независимых выборок. Предполагая показатель беременности 0,65 и целевое различие 0,18 (38), минимальный размер выборки составил 25 маток на группу. Распределённые размеры групп удовлетворяли этому требованию, обеспечивая достаточную статистическую мощность.

2.3 Протоколы синхронизации эструса

Перед синхронизацией эструса была проведена трансректальная ультрасонография в B-режиме с использованием датчика 3,5 МГц (Gandalf Electronic Technology Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай) для подтверждения того, что все матки не беременны. Для предотвращения вагинита пропитанные P4 интравагинальные губки помещали в контейнер с 3,2 млн МЕ пенициллина (Yuanye, #B25911, Китай) и 4,8 млн МЕ стрептомицина (Yuanye, #S17058, Китай) перед введением. Контейнер осторожно встряхивали в течение 5 минут для равномерного покрытия губок антибиотической смесью. Были реализованы три протокола синхронизации эструса (Группа I, II и III). В Группах I и II пропитанная P4 интравагинальная губка (Yanrui Biotechnology Co., Ltd., Яньчэн, Китай) вводилась на 12 дней; утром 12-го дня внутримышечно вводили 250 МЕ PMSG (Ningbo Second Hormone Factory, Чжэцзян, Китай), а губку удаляли во второй половине дня. Группа II дополнительно получала 0,1 мг PG (Ningbo Second Hormone Factory, Нинбо, Китай) внутримышечно при удалении губки. В Группе III вставка CIDR (Yanrui Biotechnology Co., Ltd., Яньчэн, Китай) помещалась интравагинально на 12 дней; утром 12-го дня внутримышечно вводили 250 МЕ PMSG, после чего следовало удаление CIDR и внутримышечная инъекция 0,1 мг PG во второй половине дня. Интравагинальная P4 губка и CIDR содержали 50 мг и 300 мг P4 соответственно. Конкретные протоколы и сроки обобщены на рисунке 1.

Рисунок 1 Протокол синхронизации эструса для самок коз Шаньбэйской белой пуховой породы. Синие полосы указывают продолжительность обработки P4 губкой или CIDR. Стрелки показывают время инъекций 250 МЕ PMSG, инъекций 0,1 мг PG и удаления устройства. Кружки отмечают периоды наблюдения (0–24 ч, 24–48 ч, 48–72 ч и 72–96 ч после удаления). Треугольники указывают моменты диагностики беременности с помощью ультрасонографии в B-режиме.

2.4 Выявление эструса и интрацервикальное ИО

Наблюдение за эструсом начиналось после завершения протокола синхронизации и проводилось с 4-часовыми интервалами. Эструс определялся как период, в течение которого матка стояла неподвижно и принимала садку козла, помахивая хвостом (Дополнительный рисунок 1A). Эструс считался завершённым, когда садка больше не принималась. Для оценки эффективности каждого протокола регистрировалось число маток, проявляющих эструс, в интервалах 0–24 ч, 24–48 ч, 48–72 ч и 72–96 ч после удаления губки или CIDR.

Сперма была собрана от 8 козлов с использованием искусственной вагины. Подвижность и плотность сперматозоидов оценивались с помощью фазово-контрастного микроскопа. Эякуляты, соответствующие следующим критериям, использовались для ИО: объём 0,8–1,5 мл, подвижность ≥ 85% и концентрация ≥ 2 × 109 сперматозоидов/мл. Сборы от каждого козла разделялись по крайней мере одним днём для поддержания качества спермы. Квалифицированные образцы из каждого сбора объединялись и гомогенизировались в стерилизованных центрифужных пробирках для снижения индивидуальной изменчивости. Объединённая сперма разбавлялась предварительно подогретым 0,9% физиологическим раствором (Kelun Pharmaceutical Co., Ltd., Чэнду, Китай) до конечной плотности сперматозоидов примерно 1 × 108 сперматозоидов/мл.

Интрацервикальное ИО проводилось через 12 ч после наступления эструса и повторялось через 12 ч. Все процедуры выполнялись одним и тем же техником с использованием инструмента для ИО с источником света (Xiaofuzhu Animal Husbandry Technology Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай). Объём 0,2 мл разбавленной спермы медленно вводился в цервикальный канал. Беременность подтверждалась через 30 дней после ИО с использованием ректального ультразвукового сканера в B-режиме 3,5 МГц, и рассчитывался показатель беременности. Диагностика беременности проводилась со ссылкой на Дополнительный рисунок 1B.

2.5 Расчёт затрат на препараты для синхронизации эструса

Фармацевтические затраты в данном исследовании основывались на рыночных ценах на момент исследования. Упаковка P4 губок (400 юаней) и устройство CIDR (750 юаней) обеспечивали обработку 50 маток каждая, что даёт затраты на одну матку 8 юаней и 15 юаней соответственно. Одна коробка PMSG (100 юаней) содержала пять флаконов по 1000 МЕ и могла обработать 20 маток, что равно 5 юаней на матку. Коробка PG (50 юаней) включала десять флаконов по 0,2 мг, также покрывая 20 маток, при удельной стоимости 2,5 юаня на матку. Из-за минимального использования пенициллин и стрептомицин были исключены из анализа затрат.

2.6 Наблюдение овуляции и лапароскопически ассистированное ИО в рог матки

Шестьдесят девять самок коз Шаньбэйской белой пуховой породы были случайным образом распределены на две группы. Все животные прошли синхронизацию эструса с использованием протокола Группы I, который был выбран на основе предыдущих экспериментальных результатов. Эструс контролировался с 4-часовыми интервалами. Регистрировались интервал от удаления губки до наступления эструса, продолжительность эструса и интервал от наступления эструса до овуляции. Время овуляции оценивалось начиная с 24 ч после наступления эструса, с обследованиями каждые 2 ч. Для этой процедуры матки анестезировались внутривенной инъекцией 0,4 мл анестетика (Bite Biotechnology Research Institute Co., Ltd., Чанша, Китай). После анестезии и удаления волос на животе матки помещались в дорсальное положение на хирургической стойке, фиксированной под углом 45°. Используя лапароскоп (Baiqin Medical Technology Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай) с атравматичными захватывающими щипцами, фимбрии яйцевода осторожно оттягивались для полного обнажения яичника, и точное время овуляции документировалось.

Отдельные самцы существенно различаются по криотолерантности (39). Использование объединённой спермы внесло бы смешение, затемняя, были ли результаты обусловлены методом сохранения или индивидуальностью козлов. Поэтому сперма была собрана от 1 козла. Свежая сперма была собрана и разбавлена в соответствии с установленным протоколом. Для приготовления охлаждённого разбавителя следующие компоненты были точно взвешены и объединены в стакане: 4,54 г Трис (Solarbio, #T8060, Китай), 0,2 г глюкозы (Solarbio, #G8151, Китай), 4,6 г фруктозы (Solarbio, #F8100, Китай), 1,5 г ЭДТА (Solarbio, #E8040, Китай), 2,38 г цитрата натрия (Solarbio, #SS6100, Китай), 100 000 МЕ пенициллина натрия и 100 000 МЕ сульфата стрептомицина. Эти соединения растворяли в 80 мл дважды дистиллированной воды при непрерывном перемешивании. Раствор фильтровали через фильтр 0,22 мкм в стерилизованную стеклянную бутылку и доводили до конечного объёма 100 мл. Стерилизация достигалась инкубацией в водяной бане при 56°C в течение 30 минут. Для использования 8 мл базового разбавителя смешивали с 2 мл яичного желтка. Собранная свежая сперма разбавлялась этой смесью до конечной концентрации 1 × 108 сперматозоидов/мл. Разбавленная сперма переносилась в 15-мл центрифужную пробирку, оборачивалась десятью слоями марли и хранилась при 4°C. Только образцы, показывающие > 40% подвижности после согревания в водяной бане при 37°C, использовались для лапароскопически ассистированного ИО. После лапароскопического подтверждения овуляции соответствующий рог матки осторожно выводился с помощью атравматичных щипцов. Стерилизованная скрепка использовалась для создания небольшого прокола на переднем конце, через который вводилось 0,2 мл свежей или охлаждённой спермы. После восстановления от анестезии матки возвращались в свои загоны и содержались в стандартных условиях кормления. Беременность диагностировалась через 30 дней с помощью ультрасонографии в B-режиме.

2.7 Определение концентраций LH, P4 и E2 в сыворотке крови

Предыдущие исследования указывают, что различные обработки для синхронизации эструса незначительно влияют на время пика LH или овуляции у коз (40). В течение сезона размножения образцы крови собирались путём пункции яремной вены у маток из трёх групп обработки в следующие моменты времени: удаление губки, наступление эструса, начало овуляции (32 ч после эструса) и конец эструса. Сыворотка отделялась (n = 5 на группу). Концентрации P4, LH и E2 измерялись с использованием наборов для иммуноферментного анализа (ELISA) (Enzyme Tech Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай); диапазоны обнаружения составили 35–1600 пмоль/л для P4, 0,6–35 нг/л для LH и 1,5–80 нг/л для E2. Оптическая плотность измерялась при 450 нм с использованием мультимодального микропланшетного ридера Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США). Стандартные кривые строились по известным концентрациям и соответствующим значениям оптической плотности, и концентрации образцов рассчитывались соответственно. Внутри- и меж-аналитические коэффициенты вариации составили 5,4% и 7,5% соответственно.

2.8 Статистика и анализ данных

Все статистические анализы выполнялись с использованием SPSS (версия 26.0, SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Нормальность данных оценивалась с помощью теста Шапиро-Уилка, а однородность дисперсий оценивалась с помощью теста Левена. Показатели эструса и беременности сравнивались между группами обработки с использованием критерия хи-квадрат с расчётом относительных рисков (RR) и 95% доверительных интервалов (CI). Концентрации P4, LH и E2 в сыворотке анализировались с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими апостериорными тестами LSD. P < 0,05 считалось статистически значимым.

3.1 Процент эструса у маток в различные интервалы после синхронизации эструса в сезон размножения и вне сезона размножения

Ни одна P4 губка или CIDR не были потеряны во время эксперимента. Интервал от 0–96 ч после удаления устройства рассматривался как эффективное окно синхронизации эструса. В течение сезона размножения (Таблица 1) показатели эструса значительно различались между тремя группами в течение 0–24 ч и 24–48 ч после обработки (P < 0,05), но не в более поздние интервалы (P > 0,05). Вне сезона размножения значительные различия также наблюдались в 0–24 ч, 24–48 ч и 48–72 ч (P < 0,05). В оба сезона Группа I показала значительно более высокий показатель эструса в 24–48 ч, чем в другие моменты времени (P < 0,05), в то время как Группа III достигла своего наивысшего показателя в течение 0–24 ч (P < 0,05). Напротив, Группа II демонстрировала наивысший показатель эструса в течение 0–24 ч в сезон размножения и как в 0–24 ч, так и в 24–48 ч вне сезона размножения (P < 0,05).

Таблица 1 Распределение времени концентрации эструса после обработки для синхронизации различными протоколами в сезон размножения и вне сезона размножения (%).

Группа I, P4 губка + PMSG; Группа II, P4 губка + PMSG + PG; Группа III, CIDR + PMSG + PG. Разные заглавные буквы в качестве надстрочных знаков в одной строке обозначают значительные различия в показателе эструса между протоколами в течение одного периода (P < 0,05). Разные строчные буквы в качестве надстрочных знаков в одном столбце указывают на значительные различия в показателе эструса для одного протокола в разные периоды (P < 0,05).

Выделенные жирным шрифтом значения указывают на наиболее значимый показатель эструса или беременности.

3.2 Эффективность синхронизации эструса у маток в сезон размножения и вне сезона размножения

Общие результаты по эструсу и беременности после синхронизации эструса у маток в оба сезона показаны в Таблице 2. В течение сезона размножения Группа I показала самые высокие общие показатели эструса и беременности, но они не различались значительно от таковых в Группах II и III (P > 0,05). Вне сезона размножения не было обнаружено значительных различий в общих показателях эструса или беременности между группами (P > 0,05).

Таблица 2 Общий показатель эструса и показатель беременности после обработки для синхронизации различными протоколами в сезон размножения и вне сезона размножения (%).

3.3 Стоимость препаратов для синхронизации эструса

Стоимость на одну матку и на одну беременность для трёх протоколов представлена на рисунке 2. Протокол Группы III был самым дорогим — 22,5 юаня, в то время как Группа I была наименее дорогой — 13 юаней. Группа II имела умеренную стоимость 15,5 юаня, что было немного выше, чем у Группы I (Рисунок 2A). Группа I стабильно показывала наименьшую стоимость на одну беременность в течение как сезона размножения, так и вне сезона размножения — 18,7 и 30,9 юаня соответственно. Напротив, Группа III была самой дорогой со стоимостью 34,0 и 44,1 юаня для двух сезонов (Рисунок 2B).

Рисунок 2 Затраты на препараты для протоколов синхронизации эструса. (A) Стоимость препаратов для синхронизации эструса на одну матку, (B) Стоимость препаратов на одну беременность для трёх протоколов. Группы: I (P4 губка + PMSG), II (P4 губка + PMSG + PG), III (CIDR + PMSG + PG).

3.4 Время овуляции и лапароскопически ассистированное ИО в рог матки

Исходя из эффективности и стоимости, протокол Группы I был выбран в качестве оптимальной схемы синхронизации эструса. В течение сезона размножения матки в обеих группах были синхронизированы с использованием протокола Группы I, и овуляция контролировалась с помощью лапароскопии. Результаты (Таблица 3) показали, что показатели эструса не имели значительных различий между ними (P > 0,05). Интервалы от удаления губки до наступления эструса, продолжительность эструса и интервалы от наступления эструса до овуляции — ни один из этих параметров значительно не различался (P > 0,05). Лапароскопически ассистированное ИО в рог матки показало, что показатель беременности со свежей спермой был значительно выше, чем с охлаждённой спермой (P < 0,05).

Таблица 3 Интервал от удаления губки до наступления эструса, продолжительность эструса и интервал от наступления эструса до овуляции после обработки для синхронизации протоколом Группы I в течение сезона размножения, а также лапароскопически ассистированное ИО свежей и охлаждённой спермой.

Данные, обозначенные разными буквами в одном столбце, указывают на значительные различия в показателях беременности (P < 0,05); RR, относительный риск; CI, 95% доверительные интервалы.

Выделенные жирным шрифтом значения указывают на наиболее значимый показатель эструса или беременности.

3.5 Сравнение репродуктивных гормонов у маток, обработанных различными протоколами синхронизации эструса

На рисунке 3 показаны концентрации репродуктивных гормонов у маток в различные моменты времени после синхронизации эструса. В момент наступления эструса, овуляции и окончания эструса концентрации LH были значительно выше в Группах I и III, чем в Группе II (P < 0,05). В целом уровни LH сначала повышались, а затем снижались (Рисунок 3A). После удаления устройства концентрация P4 в Группах II и III была значительно выше, чем в Группе I (P < 0,05). К моменту окончания эструса P4 в Группе I стала значительно выше, чем в Группе II (P < 0,05). Уровни P4 в целом сначала снижались, а затем повышались (Рисунок 3B). Не было обнаружено значительных различий в концентрации E2 среди трёх групп сразу после удаления устройства или в конце эструса (P > 0,05). Однако в момент наступления эструса E2 в Группе I была значительно выше, чем в Группе II, а в момент овуляции E2 в Группах I и II была значительно выше, чем в Группе III (P < 0,05). Концентрация E2 по протоколам демонстрировала первоначальное повышение с последующим снижением (Рисунок 3C).

Рисунок 3 Концентрации гормонов в сыворотке крови LH, P4, E2 у маток при различных протоколах синхронизации. (A) Уровни LH, (B) P4 и (C) E2 по группам в четырёх временных точках: после удаления устройства, наступление эструса, овуляция и окончание эструса. Группы: I (P4 губка + PMSG), II (P4 губка + PMSG + PG), III (CIDR + PMSG + PG). Разные надстрочные буквы указывают на значительные различия (P < 0,05).

Известно, что долгосрочные протоколы синхронизации на основе прогестерона (11–14 дней) ускоряют наступление эструса и значительно повышают показатели беременности у овцематок (11), и этот эффект, по-видимому, не зависит от типа прогестеронового устройства (12). Соответственно, в данном исследовании для групп использовался 12-дневный период синхронизации. Эструс обычно начинался в течение 48 ч после окончания обработки (29), что согласуется с нашими результатами: все три протокола индуцировали эструс в течение этого периода. Однако матки в Группах II и III, получавшие PG, начинали эструс раньше (0–24 ч), чем матки в Группе I (P4 губка + PMSG), что согласуется с более ранними сообщениями (41). PG быстро лизирует жёлтое тело, немедленно индуцируя эструс (21). Между тем показатель эструса в Группе I в течение 24–48 ч был значительно выше, чем в других группах. Группа III достигла своего наивысшего показателя эструса в течение 0–24 ч в оба сезона. Хотя пиковый период эструса в Группе II варьировал в зависимости от сезона, её общий показатель эструса оставался стабильным. В совокупности все три протокола эффективно индуцировали эструс у маток на разных репродуктивных стадиях.

Продолжительная стимуляция PMSG может нарушать синхронность овуляции, приводя к одновременному присутствию жёлтых тел и фолликулов в яичниках маток и нарушая экспрессию функциональных генов, таких как аквапорин 3 (AQP3) (42). В исследовании Sun и др. (43) однократная инъекция 300 МЕ PMSG привела к показателю эструса 95,8% и показателю беременности 68,18%. Однако три инъекции по 300 МЕ PMSG значительно снизили оба показателя. Эти результаты согласуются с нашими данными, свидетельствуя о том, что доза PMSG 250–300 МЕ обычно подходит для индукции эструса при сохранении удовлетворительных исходов беременности у коз. Из-за длительного периода полувыведения избыток PMSG вызывает стойкую стимуляцию яичников и повышает концентрацию антител к PMSG в фолликулах и плазме (43). Антитело связывает PMSG, образуя комплекс, который всё ещё активирует рецепторы FSH/LH фолликулов, и это приводит к временным различиям в реакции фолликулов на гонадотропин, тем самым индуцируя гетерогенность развития (44). Избыток антител также может подавлять или задерживать предовуляторный пик LH, препятствуя синхронному окончательному созреванию некоторых фолликулов (45). Эти незрелые фолликулы продолжают секретировать E2 под остаточной стимуляцией PMSG. Повышенный E2 дополнительно усугубляет асинхронность созревания, приводя к prolonged and disordered ovulation window (46). Тяжёлые проявления могут включать образование кист яичников и нарушение оплодотворения и имплантации, в конечном счёте снижая эффективность синхронизации эструса и общие репродуктивные показатели (47). Хотя эффективность эструса значительно различалась между протоколами в течение как сезона размножения, так и вне сезона размножения, общие показатели эструса и беременности не различались. Этот результат, вероятно, отражает единообразную 12-дневную продолжительность обработки и соответствующую дозировку PMSG, использованные во всех трёх протоколах. Этот подход обеспечил эффективную синхронизацию волны фолликулов, тем самым компенсируя любые дифференциальные эффекты, возникающие из-за использования различных носителей прогестагена и гормональных комбинаций (11). Интересно, что Группа II стабильно показывала самый низкий показатель беременности, вероятно, потому что PG изменяет гормональную динамику. Индуцируя быстрый лизис жёлтого тела, PG повышает уровень эстрадиола в плазме и нарушает эндогенный ритм FSH, что может вызывать плохо синхронизированный разрыв фолликулов и недостаточность жёлтого тела, нарушая имплантацию (48). Кроме того, инъекция PG снижает направленные на яйцевод сокращения матки, ограничивая транспорт сперматозоидов. В сочетании с потенциальным лёгким вагинитом от губки эти факторы также могут способствовать более низкому показателю беременности (49, 50).

Хорошо документировано, что использование прогестероновых губок повышает риск вагинита и изменяет вагинальную микробиоту у овцематок (51). Это может индуцировать гиперплазию и гипертрофию вагинального эпителия, повышая местное количество нейтрофилов, макрофагов и эритроцитов (52). Выпадение губки также является распространённым риском. В совокупности эти изменения снижают половую привлекательность овцематок (53), и в сочетании с повышенной бактериальной нагрузкой и гнойными выделениями могут нарушать функцию и выживаемость сперматозоидов после ИО (54). Следовательно, адъювантная антибиотикотерапия обычно используется для снижения частоты вагинита (55), и хотя она эффективна против гнойных выделений, она может не улучшать исходы беременности (56). Альтернативно, устройства CIDR, вероятно, снижают вагинит, но увеличивают стоимость (14). В нашем исследовании прогестероновые губки сочетались с антибиотиками для предотвращения вагинита, и выпадения губок не происходило. Показатели эструса и беременности в этих группах не были значительно ниже, чем у маток, обработанных CIDR. Это согласуется с данными о том, что введение антибиотиков, хотя и не полностью предотвращает вагинит, не нарушает фертильность (57). Кроме того, был проведён сравнительный анализ преимуществ и недостатков трёх протоколов (Таблица 4). Определяющими характеристиками являются метод доставки прогестерона и использование PG, которые коррелируют с их пригодностью для ферм различного масштаба. Основное преимущество Группы I — её низкая стоимость, что делает её применимой для мелкомасштабных или ограниченных в ресурсах хозяйств. Группа II, которая включает PG для регрессии жёлтого тела, обеспечивает более быстрое наступление эструса при относительно низких дополнительных затратах. Общим ограничением как Группы I, так и Группы II является их сниженная эффективность вне сезона размножения в сочетании с повышенным риском вагинита (51). Группа III, напротив, обеспечивает простоту применения и улучшенный комфорт животных за счёт поддержания стабильного уровня прогестерона, что приводит к лучшей синхронизации. Тем не менее её высокая удельная стоимость является значительным барьером, что ограничивает её полезность в экстенсивных системах производства (58). Помимо репродуктивных показателей, стоимость протоколов синхронизации является критическим соображением для управления фермой. Более высокие расходы на препараты не соответствовали значительным улучшениям реакции эструса или репродуктивных исходов (59). Учитывая как стоимость, так и эффективность, протокол Группы I рекомендуется в качестве оптимальной схемы синхронизации эструса для маток.

Таблица 4 Сравнение преимуществ и недостатков трёх протоколов синхронизации эструса.

По сравнению с традиционным цервикальным ИО лапароскопия позволяет непосредственно наблюдать овуляцию и сокращает расстояние, которое должны преодолеть сперматозоиды, улучшая показатели оплодотворения и позволяя своевременно оценивать здоровье яичников и матки. Этот метод также помогает выявлять и удалять маток с гипоплазией яичников или кистами (33). Учитывая благоприятные исходы и экономическую эффективность протокола Группы I, лапароскопия использовалась для определения времени овуляции. Овуляция происходила примерно через 32 ч после эструса в обеих группах, без значительных различий в показателях синхронизированного эструса, интервале от удаления губки до наступления эструса или продолжительности эструса. Эти результаты подтверждают, что протокол Группы I надёжно индуцирует эструс и овуляцию у маток. Однако показатель беременности после лапароскопически ассистированного ИО превысил 90% со свежей спермой, что значительно выше, чем с охлаждённой спермой. Предыдущие исследования показывают, что использование только желтка в качестве криопротектора может снизить подвижность сперматозоидов более чем на 45% и заметно нарушить целостность плазматической мембраны и антиоксидантную способность (60), что, вероятно, объясняет более низкие показатели беременности с охлаждённой спермой. В summary, протокол Группы I эффективно индуцирует эструс и овуляцию, а проведение ИО в течение примерно 32 ч после эструса значительно повышает показатель беременности у маток.

Наши исследования установили, что овуляция у маток, обработанных протоколом Группы I, происходит примерно через 32 ч после эструса, без значительной связи между временем пика LH, временем овуляции и используемым протоколом синхронизации (28). Поэтому концентрации LH, P4 и E2 в сыворотке измерялись в четырёх временных точках: после удаления губки, в момент наступления эструса, в момент овуляции (32 ч после наступления эструса) и в конце эструса. В целом уровни P4 быстро снижались, а затем постепенно повышались во всех протоколах, в то время как уровни LH и E2 сначала медленно повышались, а затем снижались. В частности, удаление губки/CIDR прекращало экзогенную поставку P4, вызывая быстрое падение P4. Это падение снижало отрицательную обратную связь на гипоталамо-гипофизарной оси (10). Под стимуляцией гипофизарного FSH и экзогенного PMSG фолликулы синхронно рекрутировались и развивались (17). В этом процессе гранулёзные клетки производили большие количества E2, которые непосредственно индуцировали поведение эструса (61). Пик LH затем запускает окончательное созревание фолликулов и последующую овуляцию (19), и низкие периовуляторные уровни P4 инициируют этот пик LH (62). После овуляции уровни LH, P4 и E2 постепенно возвращались к базальным. В данном исследовании в момент овуляции LH был значительно выше в Группах I и III, чем в Группе II, в то время как E2 в момент наступления эструса был выше в Группе I, чем в Группе II. Эти гормональные различия, вероятно, объясняют самые низкие показатели эструса и беременности в Группе II, поскольку более высокие уровни E2 и LH способствуют эффективному поведению эструса и овуляции (63).

Хотя данное исследование определило подходящий протокол синхронизации эструса для интенсивного козоводства и продемонстрировало эффективность лапароскопического ИО со свежей и охлаждённой спермой в оптимальных условиях, предоставляя практические данные для отрасли, оно имеет несколько ограничений. Во-первых, работа использовала только коз Шаньбэйской белой пуховой породы. Репродуктивная физиология этой породы, включая её гормональную чувствительность, может отличаться от других, ограничивая прямую экстраполяцию выводов на мультипородные системы. Во-вторых, все испытания проводились на одной ферме с единообразным управлением и операторами. На практике изменчивость в facilities, управлении и технических навыках между фермами может влиять на исходы протоколов. В-третьих, мы применяли фиксированную дозу PMSG (250 МЕ) на основе литературы, без тестирования градиента доз. Оптимальная доза PMSG, вероятно, взаимодействует с массой тела, возрастом, паритетом и сезоном; таким образом, наше исследование не могло определить эффекты доза-ответ или идентифицировать породо- или состояние-специфичные оптимумы. Наконец, сравнение лапароскопически ассистированного ИО со свежей и охлаждённой спермой было проведено с использованием спермы только от одного козла. Этот дизайн эффективно контролировал межсамцовую изменчивость, чётко продемонстрировал исходы беременности для обоих типов спермы и позволил отнести наблюдаемое различие к методу сохранения. Однако, поскольку отдельные козлы различаются по толерантности своей спермы к криоконсервации, результаты могут быть не непосредственно обобщаемы на всех козлов. Кроме того, лапароскопическое ИО с замороженной спермой в рамках оптимального протокола не было валидировано, что ограничивает применимость протокола и не позволяет предоставить технический справочник для использования замороженной спермы. Будущие исследования должны проверить эти findings in multiple breeds, оптимизировать гормональные дозы, сравнить исходы ИО по типам сохранения спермы, включая замороженную, на основе большей когорты козлов, и провести детальный долгосрочный анализ затрат и выгод.

В summary, протокол I (P4 губка + PMSG) продемонстрировал эффективность в синхронизации эструса, поддержке овуляции и достижении беременности путём ИО. Оценка стоимости лекарственной обработки на одну матку и на одну беременность для трёх протоколов показала, что Группа I имела наименьшую стоимость на одну матку — всего 13 юаней. Она также имела наименьшую стоимость на одну беременность в оба сезона: 18,7 юаня в сезон размножения и 30,9 юаня вне сезона размножения. Поэтому, учитывая индуцированный показатель эструса, показатель беременности и затраты на препараты, Группа I рекомендуется в качестве оптимального протокола синхронизации для коз Шаньбэйской белой пуховой породы, обеспечивая поддержку данных для интенсивного разведения и племенного производства коз.

Дополнительные материалы к данной статье можно найти онлайн по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2026.1743340/full#supplementary-material

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ РИСУНОК 1

Выявление эструса и ультразвуковая диагностика беременности у маток. (A) Матки в состоянии эструса, которых покрывает козёл. (B) Беременность, подтверждённая с помощью ультрасонографии через 30 дней после ИО, с ранним эмбриональным пузырьком, отмеченным красным кругом.

Wang C, Liu X, Shang S, Wang Z, Yun X, Liu J, Du X, Zhai J, Wang F, Wang M, Hua J, Zhu H and Qu L (2026) Hormone guided estrus synchronization using progesterone sponge and PMSG in goats: a cost-effective optimization strategy. Front. Vet. Sci. 13:1743340. doi: 10.3389/fvets.2026.1743340

Перевод статьи «Hormone guided estrus synchronization using progesterone sponge and PMSG in goats: a cost-effective optimization strategy» авторов Wang C, Liu X, Shang S, Wang Z, Yun X, Liu J, Du X, Zhai J, Wang F, Wang M, Hua J, Zhu H and Qu L., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык