Как погода и севооборот влияют на здоровье корней конских бобов

В период с 2016 по 2019 год в Германии было проведено обследование для оценки влияния системы управления (органическое vs традиционное), почвенно-климатических условий и истории севооборота на состояние корневой системы конских бобов, разнообразие основных возбудителей корневой гнили и урожайность.

Распространённость корневой гнили в целом была низкой, и система управления не оказала влияния на спектр выделенных патогенов. Среди наиболее часто идентифицируемых видов грибов частота встречаемости Fusarium redolens и Didymella pinodella была значительно выше в корнях с органических полей по сравнению с традиционными, тогда как для F. avenaceum, F. tricinctum и F. culmorum наблюдалась более низкая частота. Корни конских бобов в равной степени колонизировались F. equiseti, а также представителями видовых комплексов F. oxysporum (FOSC) и F. solani (FSSC) в обеих системах земледелия. За 5–11 лет, предшествовавших обследованию традиционных посевов конских бобов, бобовые культуры почти не выращивались, тогда как в органических полях в течение этого периода бобовые почти всегда присутствовали. Это различие в истории севооборотов между системами земледелия привело к очевидному влиянию систем возделывания на частоту выделения некоторых видов. Например, D. pinodella была повсеместно распространена в органических полях с высокой долей бобовых в севооборотах, но встречалась гораздо реже и часто отсутствовала на традиционных полях. Почвенно-климатические условия, особенно прохладная погода во время посева и появления всходов и/или в период вегетации, благоприятствовали большинству наиболее распространённых видов Fusarium, выявленных в этом исследовании. В органических системах урожайность отрицательно коррелировала с частотой встречаемости D. pinodella и F. redolens, тогда как более высокие уровни F. tricinctum в корнях конских бобов имели положительную корреляцию с урожайностью. В традиционных системах урожайность конских бобов в большей степени зависела от общего количества осадков перед посевом и в течение основного вегетационного периода, но также отрицательно коррелировала с частотой встречаемости FOSC и F. culmorum. Филогенетический анализ на основе локуса TEF1 alpha показал, что изоляты FSSC в основном принадлежали к линии F. pisi. Напротив, изоляты FOSC были отнесены к 9 различным линиям, с заметным доминированием F. libertatis, который до сих пор не был связан ни с одним бобовым растением-хозяином.

Корневые и прикорневые гнили, вызываемые комплексом почвенных патогенов, относятся к числу наиболее распространенных и значимых заболеваний зернобобовых культур и являются одним из основных ограничивающих факторов в их производстве по всему миру (Wille и др., 2019). С данным заболеванием чаще всего ассоциируются несколько видов Fusarium, Aphanomyces euteiches, а также патогены комплекса Ascochyta — Didymella pinodella и D. pinodes (Baćanović-Šišić и др., 2018; Wille и др., 2019). В полевых условиях растения обычно колонизируются несколькими патогенами одновременно, при этом значимость каждого вида варьирует в зависимости от географического региона, почвенно-климатических условий и стратегии возделывания культуры (Esmaeili Taheri и др., 2016; Naseri и Ansari Hamadani, 2017; Baćanović-Šišić и др., 2018; Chatterton и др., 2019; Williamson-Benavides и Dhingra, 2021). Например, на севере США и в Канаде F. avenaceum совместно с Aphanomyces eutheiches представляет собой серьезную угрозу для производства гороха и чечевицы (Chittem и др., 2015; Chatterton и др., 2019), тогда как во Франции и североевропейских странах, включая Данию и Швецию, помимо A. euteiches и F. avenaceum, важную роль в районах возделывания гороха играют F. solani, F. redolens и Didymella pinodella (syn. Phoma medicaginis var. pinodella) (Persson и др., 1997; Hossain и др., 2012; Gibert и др., 2022). Другие патогены, такие как Rhizoctonia solani, виды Pythium, Thielaviopsis basicola и Macrophomina phaseolina, также рассматриваются как важные составляющие комплекса корневых гнилей зернобобовых (Naseri и Mousavi, 2015; Wille и др., 2019; Williamson-Benavides и Dhingra, 2021; Wohor и др., 2022).

За последние 15 лет в Германии было проведено два крупных обследования корневых гнилей зернобобовых культур. Первое (2005–2007 гг.) было посвящено оценке состояния корневой системы традиционно возделываемого гороха, включая детальную идентификацию вовлеченных патогенов на основе морфологических признаков (Pflughöft и др., 2012). Это обследование показало снижение значимости F. solani и F. oxysporum, тогда как D. pinodella совместно с F. redolens и F. avenaceum были идентифицированы как основные патогены в комплексе корневых гнилей гороха в Германии. Второе обследование (2008–2012 гг.) проводилось в четырех регионах Германии и, помимо гороха, также охватывало конские бобы, но только на органических полях (Wilbois и др., 2013). Это обследование было сосредоточено исключительно на оценке состояния растений в полях и, хотя указывало на важность видов Fusarium, не идентифицировало основные виды Fusarium, вовлеченные в комплекс корневых гнилей органического гороха и конских бобов. Хотя конские бобы обычно выглядели здоровее гороха, они часто были носителями тех же патогенов, что и горох (Pflughöft и др., 2012; Wilbois и др., 2013). Информация о патогенах, ассоциированных с традиционно возделываемыми конскими бобами в Германии, отсутствует. Поскольку патогенный комплекс в целом имеет широкий круг хозяев среди бобовых и, кроме того, особенно виды Fusarium часто поражают злаковые культуры (Bainard и др., 2017; Walder и др., 2017), фермеры вынуждены возделывать зернобобовые в широких севооборотах, чтобы избежать проблем с болезнями.

В результате новой стратегии в отношении белковых культур, принятой в 2012 году Федеральным министерством продовольствия и сельского хозяйства Германии, и мер по экологизации Единой аграрной политики (CAP) ЕС в 2015 году, площадь возделывания конских бобов в Германии увеличилась в четыре раза с 2014 года и составила около 60 000 га в 2020 году. Чтобы избежать накопления инфекционного начала и поддерживать или увеличивать площади, занятые под конскими бобами и зернобобовыми в целом, необходимо оценить текущие патологические риски для планирования севооборотов. Общей целью данного исследования было определение состояния корневой системы органических и традиционных конских бобов в Германии и характеристика разнообразия и частоты встречаемости ассоциированных с корнями патогенов под влиянием системы земледелия, почвенно-климатических условий и управления севооборотом. Далее мы сообщаем о влиянии состояния корневой системы и заражения корней основными видами грибов на урожайность конских бобов и предоставляем сведения о генетической изменчивости выделенных изолятов F. oxysporum и F. solani.

Погодные данные, история возделывания и характеристика участков

В период с 2016 по 2019 год было отобрано в общей сложности 110 полей конских бобов по всей Германии (Рисунок 1). Из них 53 обследованных поля управлялись органически в соответствии со стандартами Европейского союза и национальными стандартами, а 57 полей — традиционно. Метеорологические данные были получены с ближайших к полям метеостанций (<10 км). Содержание песка, суглинка, глины и органического вещества почвы, а также pH определяли в соответствии со стандартом DIN EN ISO/IEC 17025:2018-03. Данные по истории возделывания были получены непосредственно от фермеров. Они включали количество лет, в течение которых поля были заняты различными бобовыми видами (т.е. видами клевера и люцерной, горохом, конскими бобами, чечевицей, люпином, соей, викой и неспецифицированной группой «другие зернобобовые» или «мелкосемянные бобовые») и количество лет возделывания злаковых (обобщенные данные по всем зерновым культурам) за 5- и 11-летний период, предшествовавший отбору проб конских бобов. Полный набор данных приведен в Дополнительной таблице 1.

Рисунок 1 Карта Германии с указанием местоположения и типов почв обследованных органических и традиционных полей конских бобов.

Отбор проб, оценка болезней, морфологическая характеристика изолятов и оценка урожайности

От 36 до 40 растений конских бобов выдергивали с корнями в фазу полного цветения с двух участков на каждом поле, каждый площадью 5 м², с расстоянием между двумя участками от 10 до 20 метров в зависимости от поля. Корни половины растений немедленно отмывали для удаления прилипшей почвы, и каждое растение оценивали по степени выраженности симптомов корневой гнили с использованием визуальной 9-балльной шкалы (1 = здоровое растение, 9 = отмирающее растение) на основе уровня обесцвечивания тканей наружных корней (Рисунок 2) в соответствии с Pflughöft и др. (2012). Оставшуюся половину отобранных корней отправляли в Университет Касселя и хранили при -18°C до проведения грибных изоляций, как описано ранее (Šišić и др., 2018b). Изоляции были направлены на виды, принадлежащие к роду Fusarium, и виды со сходной с Didymella (Phoma) морфологией, поскольку ранее они были идентифицированы как наиболее распространенные патогены, ассоциированные с полевым горохом и конскими бобами в Германии (Pflughöft и др., 2012; Wilbois и др., 2013; Baćanović-Šišić и др., 2018). Кратко: корни тщательно промывали под проточной водопроводной водой, поверхностно стерилизовали 3% гипохлоритом натрия в течение 10 с, ополаскивали дистиллированной водой и помещали на фильтровальную бумагу под ламинарный бокс на ≥1 ч. По три фрагмента длиной примерно 1 см от каждого растения (корень, корневая шейка и переходная зона) помещали на среду COONs (Coons, 1916) и инкубировали при 20°C в условиях 12-часовых циклов УФ-света и темноты. Корни включали как боковые, так и стержневые корни вплоть до места прикрепления семени; корневой шейкой считали место прикрепления семени до примерно 0,5 см ниже поверхности почвы, а переходная зона охватывала около 1,5 см между корневой шейкой и стеблем.

Рисунок 2 Различные уровни обесцвечивания корней и соответствующие им показатели тяжести корневой гнили (1 = здоровое растение, 9 = отмирающее растение). Растения с показателями тяжести болезни 8 и 9 (т.е. с сильной гнилью) в ходе обследования не наблюдались.

После 1–2 недель инкубации развивающиеся из фрагментов корней грибные колонии пересевали отдельно в чашки Петри, содержащие картофельно-декстрозный агар половинной концентрации (19 г/л Difco PDA и 10 г/л агара). Чистые культуры получали либо путем пересева гифальной верхушки (морфология Fusarium), либо переноса одиночных пикнид (морфология Didymella). Каждый изолят исследовали микроскопически и идентифицировали до видового уровня на основе внешнего вида культуры (цвет колонии и пигментация) и морфологии конидиогенных клеток, следуя протоколам Leslie и Summerell (2006) для видов Fusarium и Boerema и др. (2004) для видов Didymella.

Урожайность зерна определяли путем ручной уборки растений с пяти участков площадью 0,5 м² в пределах каждого из двух участков площадью 5 м², использованных для сбора корней. Урожайность корректировали до 86% сухого вещества.

Молекулярное подтверждение видовой идентичности грибов и филогенетический анализ

Идентичность 120 случайно выбранных изолятов Fusarium и 8 изолятов Didymella, полученных в данном исследовании и представляющих 11 различных видов грибов (Дополнительная таблица 2), была подтверждена секвенированием участка гена фактора элонгации трансляции 1 (TEF1) альфа для видов Fusarium (O’Donnell и др., 1998) и участка гена бета-тубулина для видов Didymella (Chen и др., 2015). Выделение ДНК, амплификация ПЦР, секвенирование и анализ первичных данных последовательностей выполнялись, как описано ранее (Šišić и др., 2018a). Кратко: геномную ДНК экстрагировали из чистых культур, растущих на агаровых пластинах с картофельно-декстрозным агаром половинной концентрации (Fusarium spp.; ½ концентрации PDA; 19 г/л Difco PDA и 10 г/л агара) или среде Coons (Didymella spp.; Coons, 1916), используя протокол, описанный Doyle и Doyle (1987). Участок гена фактора элонгации трансляции 1 альфа (tef1) амплифицировали с использованием пар праймеров EF1 и EF2 (O’Donnell и др., 1998). Участок гена β-тубулина (tub2) амплифицировали с использованием праймеров Btub2Fd и Btub4Rd (Chen и др., 2015). Ампликоны визуализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и очищали с использованием набора DNA Clean & Concentrator kit (Zymo Research, Фрайбург, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Секвенирование по Сэнгеру в обоих направлениях выполняла компания Macrogen Europe Laboratories (Амстердам, Нидерланды). Полученные данные первичных последовательностей были собраны, а ошибки идентифицированы и исправлены вручную в программе SeqMan Lasergene (DNAStar, Мэдисон, Висконсин, США). Для подтверждения таксономической идентичности изолятов эти последовательности использовали в качестве запросов в базах данных Fusarium-ID v. 1.0 (Geiser и др., 2004) и NCBI (Madden, 2002).

Филогенетический анализ

Однолокусный филогенетический анализ на основе последовательностей гена TEF1 альфа был выполнен для 35 изолятов комплекса видов Fusarium oxysporum (FOSC) и 33 изолятов комплекса видов Fusarium solani (FSSC). Референтные последовательности для анализа были выбраны на основе ранее опубликованных филогенетических взаимосвязей внутри FOSC (O’Donnell и др., 2009; Lombard и др., 2018) и FSSC (O’Donnell и др., 2020; Geiser и др., 2021) (Дополнительные таблицы 3 и 4). Выравнивания последовательностей были созданы с использованием MAFFT v.7 (Katoh и Standley, 2013) и дополнительно откорректированы вручную с помощью MEGA v6 (Tamura и др., 2013). Бутстреп-анализ методом максимального правдоподобия (ML) был выполнен с использованием RAxML-VI-HPC v. 7.0.3 с непараметрическим бутстрепом и 1000 репликами, реализованным на портале Cipres (Stamatakis и др., 2008). Для FOSC мы сначала провели филогенетический анализ на наборе данных, который включал 174 репрезентативных изолята из исследования O’Donnel и др. (2009) и 91 изолят из исследования Lombard и др. (2018). Полученная топология дерева TEF1 альфа выявила несколько изолятов, принадлежащих к одной и той же форме специальной, имеющих идентичные или сходные последовательности гена TEF1 альфа. Они были исключены из последующего анализа, в результате чего был получен набор данных, состоящий из 181 последовательности FOSC. Набор данных FSSC состоял из 96 последовательностей TEF1 (Дополнительные таблицы 2–4). Для целей аутгруппировки для построения филогенетических деревьев использовались F. udum (CBS 177.31) и F. thapsinum (H05-557S-1 DCPA).

Статистический анализ

Все статистические анализы выполнялись в R (R Core Team, 2013). Перед анализом численность отдельных видов грибов была использована для расчета частот выделения (т.е. процента колонизированных корней) путем деления количества корней, в которых был обнаружен данный вид, на общее количество обработанных корней. Поля были дополнительно оценены как положительные или отрицательные на наличие конкретного вида гриба, и эти данные использовались для расчета распространенности каждого патогена в каждой системе управления (органической и традиционной) путем деления количества полей, в которых присутствовал каждый вид, на общее количество обследованных полей. Кроме того, частота встречаемости корневой гнили для каждой системы управления была рассчитана как процент полей со средним баллом тяжести болезни более 3, т.е. корней с четко выраженными симптомами (Рисунок 2).

При анализе частот выделения отдельных видов грибов, ассоциированных с корнями конских бобов, редкие виды (т.е. <2% от общего числа изолятов) не учитывались. Чтобы определить, влияют ли на частоту выделения система управления или год отбора проб, был проведен обобщенный линейный смешанный анализ на пропорциональных данных с биномиальным распределением и логит-функцией связи (Brooks и др., 2017). Поля использовались в качестве случайных эффектов, а для учета двух участков отбора проб в каждом поле реплики отбора проб были вложены в них. В данных, анализируемых по годам, год также использовался в качестве случайного эффекта. Распространенность видов грибов и частота встречаемости корневой гнили (доля полей со средним баллом тяжести болезни > 3; Chatterton и др., 2019) обрабатывались как бинарные данные (наличие/отсутствие) и анализировались с помощью байесовской обобщенной линейной модели и логит-функции связи (пакет ‘arm’, Su и др., 2018). Качество соответствия моделей оценивалось с помощью критериев хи-квадрат Пирсона для остатков и дополнительно проверялось с помощью теста Колмогорова–Смирнова на нормальность и проверкой на наличие потенциально значимых выбросов в данных (пакет ‘DHARMa’, Hartig, 2021). Данные также визуально проверялись на нормальность путем построения графиков остатков Пирсона против ожидаемых значений (пакет ‘ggplot2’, Wickham, 2016). Значимость основных эффектов в обобщенных линейных моделях оценивалась с помощью функции ANOVA с маргинальной суммой квадратов типа III (пакет ‘arm’). При обнаружении значимых эффектов обработки проводились сравнения наименьших средних квадратов с поправкой Тьюки по уровням эффекта (P < 0,05) (пакет ‘lsmeans’, Lenth, 2016).

Данные по тяжести корневой гнили анализировались с помощью непараметрической ранговой процедуры критерия Краскела-Уоллиса (Conover, 1999) с использованием пакета ‘agricolae’ (Mendiburu, 2014). Система управления и/или год были включены в качестве основных объясняющих переменных. При обнаружении значимых эффектов обработки (P<0,05) средние значения рангов разделяли с помощью множественного критерия сравнения Краскела. Для обоих тестов — критерия Краскела-Уоллиса и множественного критерия сравнения Краскела — использовалась пошаговая корректировка P-значений Бенджамини и Хохберга (Benjamini и Hochberg, 1995) для контроля частоты ложных открытий (FDR) и уменьшения ошибок I типа.

Взаимосвязь между частотами отдельных видов грибов и данными о частоте встречаемости корневой гнили, включая почвенно-климатические факторы, эффекты севооборота и урожайности, изучалась с помощью путевого анализа (пакет ‘lavaan’, Rosseel, 2012). Перед анализом были удалены сильно коррелирующие переменные окружающей среды (коэффициент корреляции Пирсона r ≥ ± 0,7). Затем данные были подвергнуты пошаговой процедуре прямого отбора (пакет ‘stats’, R Core Team, 2013), и в путевом анализе были сохранены только значимые переменные. Кроме того, отдельные почвенные кластеры обследованных полей использовались в качестве кластерных записей, сгруппированных на основе их сходства по абиотическим свойствам почвы (содержание песка, суглинка, глины, органического вещества почвы и pH) с использованием иерархической кластеризации по главным компонентам (HCPC) (пакет ‘FactoMineR’, Lê и др., 2008).

Экологические условия обследованных полей

110 обследованных органических и традиционных полей конских бобов представляли широкий спектр условий по почвенным и климатическим характеристикам (Таблица 1). Органические и традиционные поля были расположены на почвах от песчаных до суглинистых; в органических и традиционных полях наблюдалась большая вариабельность содержания органического вещества почвы (SOM) и умеренные диапазоны pH.

Таблица 1 Диапазон почвенно-климатических условий для полей конских бобов, обследованных в 2016–2019 гг.

Условия посева варьировали от очень влажных (до 59 мм осадков за 2 недели до посева) до полного отсутствия осадков за тот же период и от очень холодных почв (минимальная средняя температура за две недели до посева -3,8°C) до очень теплых (максимальная средняя температура до посева 13,8°C). Наиболее засушливые условия наблюдались в 2018 году, когда одно поле получило всего 21 мм осадков, а наиболее влажные — в 2016 году, когда одно поле получило 517 мм осадков за период от посева до отбора проб (Таблица 1 и Дополнительная таблица 1).

Иерархическая кластеризация полей конских бобов по главным компонентам (HCPC) на основе сходства по почвенным параметрам (pH почвы, содержание песка, суглинка, глины и органического вещества (SOM)) сгруппировала 110 полей конских бобов в три кластера (кластер I, II и III) (Рисунок 3). Первые два измерения PCA суммировали 77% изменчивости данных. Измерение 1 объясняло 50,6% дисперсии и разделяло поля кластера I от полей кластеров II и III на основе различий в значениях pH почвы, содержании песка и суглинка. Измерение 2 объясняло 26,8% дисперсии и разделяло кластеры в основном на основе различий в содержании SOM, которое также положительно коррелировало с содержанием глины в почве (например, кластер III) (Рисунок 3 и Таблица 2). Измерение 3 PCA объясняло дополнительные 14,9% изменчивости данных и было наиболее сильно связано с pH (не показано).

Рисунок 3 Кластерный анализ 110 органических и традиционных полей конских бобов на основе их сходства по абиотическим свойствам почвы.

Таблица 2 Количество органических и традиционных полей по годам, сгруппированных по сходству абиотических свойств почвы.

Кластер 1 включал 12 органических и 8 традиционных полей, классифицированных как песчаные суглинки и характеризующихся более низким pH (около 6,0) по сравнению с кластерами II и III (около 6,7), и средним содержанием SOM 2,3% и 2,4% в органических и традиционных полях соответственно (Рисунок 3 и Таблица 2). Кластер II включал 30 органических и 40 традиционных полей, ассоциированных с суглинистыми почвами с более высоким pH (около 6,7), но с содержанием SOM, сходным с кластером I (Рисунок 3 и Таблица 2). Кластер III включал 11 органических и 9 традиционных полей. Он включал суглинисто-глинистые почвы, но с более высоким содержанием глины и SOM (около 3,6%), чем кластер II (SOM около 2,4%) (Рисунок 3 и Таблица 2).

История севооборотов

В среднем по всем полям за 5-летний период, предшествовавший отбору проб конских бобов, около 26% культур в севооборотах при органическом управлении составляли бобовые. Из них примерно 70% приходилось на клевер и люцерну и около 30% — на зернобобовые (в основном горох и конские бобы — см. ниже; далее — зернобобовые). Напротив, бобовые в традиционных полях составляли только около 5% культур в 5-летнем плане севооборота. Доля злаковых в органических и традиционных севооборотах была сходной и составляла 57% (органические) и 68% (традиционные) от всех культур. Общие частоты бобовых и злаковых за 11-летний период в обеих системах управления были сходны с 5-летним планом севооборота (Дополнительная таблица 5).

В органических полях 37 из 52 (71%) полей, по которым имелись данные, за последние пять лет были засеяны бобовыми в качестве основных или промежуточных культур (Рисунок 4A). Клевер и люцерна выращивались на 32 (62%) полях, обычно в течение одного-двух лет, а зернобобовые — на 17 (32%) полях в течение одного-двух сезонов. Также злаковые были частью севооборота в течение предшествующих 5 лет, обычно в течение двух-трех сезонов (73% органических полей; Дополнительная таблица 6). Напротив, 43 (75%) традиционных поля не были засеяны бобовыми за предшествующие 5 лет (Рисунок 4A). Двенадцать из оставшихся 14 полей (25%) были засеяны один раз конскими бобами, одно — горохом в этот период и одно — мелкосемянными бобовыми. В большинстве севооборотов (48 из 57 полей; 84%) злаковые выращивались в течение трех или четырех лет, а на пяти полях — даже 5 лет, тогда как на одном традиционном поле злаковые не выращивались (Рисунок 4B и Дополнительная таблица 6). При рассмотрении последних 11 лет перед отбором проб конских бобов почти все органические фермеры выращивали бобовые по крайней мере один раз, тогда как 32 из 57 традиционных фермеров не выращивали бобовые в течение как минимум 11 лет или дольше (Рисунок 4B).

Рисунок 4 Доля бобовых в органических и традиционных севооборотах. (A) Количество полей и лет с момента последнего выращивания бобовых перед отбором проб конских бобов. Информация за 11 и более лет отсутствует. (B) Количество полей в зависимости от частоты посева бобовых за пятилетний период, предшествовавший отбору проб конских бобов.

Частота встречаемости корневой гнили и состояние корневой системы

Общие показатели тяжести болезни (DSR) достоверно не различались между системами управления (средний DSR 2,6 и 2,0 для органической и традиционной системы соответственно) или по годам (P≥0,28). Однако наблюдалась разница в доле органических и традиционных полей с четко выраженными симптомами корневой гнили (т.е. частота встречаемости корневой гнили, средний DSR>3). Растения конских бобов на 18 из 53 органических полей (34%) имели средний DSR>3, что достоверно (P=0,03) больше, чем на традиционных полях (9/57, 16%), с некоторой вариацией по годам (Таблица 3). Тем не менее, даже на органических полях средняя тяжесть корневой гнили обычно лишь незначительно превышала пороговый уровень 3, и не было существенной разницы в общей тяжести симптомов корневой гнили между системами управления (поля со средним DSR>3; Таблица 3).

Таблица 3 Средняя частота встречаемости корневой гнили (%) и показатели тяжести корневой гнили (DSR) на полях конских бобов в Германии, 2016–2019 гг.

Средние значения в строке по годам, за которыми следуют разные буквы, достоверно различаются (сравнения скорректированных по Тьюки наименьших средних квадратов для данных по частоте; post hoc тест Краскела для данных по тяжести болезни (P < 0,05)).

d Все корни, отобранные в органических полях в 2019 г. и традиционных полях в 2017 и 2019 гг., выглядели здоровыми (DSR < 3).

По годам наибольшая частота встречаемости корневой гнили в обеих системах управления была зафиксирована в 2016 году (58% органических и 36% традиционных полей), за которым следовал 2018 год (50% органических и 29% традиционных полей). В 2017 году все корни, собранные с традиционных полей, не имели видимых симптомов гнили (средний DSR<3), тогда как корни, собранные с 21% органических полей, были симптоматичными (средний DSR>3). В 2019 году все корни, собранные в обеих системах управления, выглядели здоровыми (средний DSR<3).

Виды грибов, ассоциированные с корневыми инфекциями

Из общего числа 2175 корней, проанализированных за четыре года, 1939 дали рост грибных изолятов. Всего из 110 полей было получено 4213 изолятов Fusarium и 490 изолятов, подобных Didymella. Из них 49,7% (n=2093) изолятов Fusarium и 91,8% (n=450) изолятов Didymella происходили с органически управляемых полей (N = 53 поля; n = 946 корней), тогда как остальные 50,3% (n=2093) изолятов Fusarium и 8,2% (n=40) изолятов Didymella были получены с традиционных полей (N=57; n=993).

В среднем по годам и системам управления наиболее частыми были представители комплекса видов Fusarium oxysporum (FOSC; 36% колонизированных корней), F. redolens (34%), представители комплекса видов F. solani (FSSC; 27%) и F. avenaceum (23%). Вместе они составляли 74% всех выделенных изолятов и встречались на 82–94% полей. Следующими по частоте видами Fusarium были F. tricinctum, F. culmorum и F. equiseti, которые выделялись из 6% (F. equiseti) до 11% (F. tricinctum) корней. Didymella pinodella была выделена из 17% всех корней, но встречалась в основном в органических полях с общей частотой выделения 31%. Последние четыре вида вместе составляли 23% всех выделенных изолятов и обнаруживались на 44–54% полей по годам. Виды, выделяемые с частотой ≤ 2%, включали семь видов Fusarium и один вид Didymella: F. acuminatum, F. graminearum, F. crookwalance, F. torulosum, F. sporotrichioides, F. sambucinum, F. flocciferum (Šišić и др., 2020) и D. eupyrena (syn. Juxtiphoma eupyrena).

По годам частоты F. redolens и D. pinodella были значительно выше в корнях из органических полей по сравнению с традиционными. Напротив, F. avenaceum, F. tricinctum и F. culmorum чаще колонизировали корни в традиционно управляемых полях (для всех сравнений P < 0,01). Общие средние частоты выделения видов внутри комплексов F. oxysporum и F. solani, а также средние частоты выделения F. equiseti достоверно не различались между системами управления (Рисунок 5A).

Рисунок 5 Влияние системы управления на (A) частоту выделения (%) и (B) распространенность (% полей, давших данный вид) восьми наиболее распространенных видов грибов, выделенных из корней конских бобов. Звездочками обозначены достоверные различия (P < 0,05) между органическими и традиционными полями для каждого вида гриба отдельно (попарные сравнения скорректированных по Тьюки наименьших средних квадратов). n = количество корней, N = количество оцененных полей. Горизонтальная линия на графике показывает медианное значение, нижняя и верхняя границы прямоугольника — 25-й и 75-й процентили, вертикальные линии — минимальное и максимальное значения, выбросы отмечены точками. Средние значения отмечены треугольниками.

За небольшими исключениями тенденции, наблюдаемые по годам, были сходными в пределах каждого года (Таблица 4). Например, в 2016–2018 гг. F. redolens чаще встречался в корнях органически выращенных конских бобов (от 31 до 66%) по сравнению с традиционно выращенными конскими бобами (от 17 до 44%), тогда как в 2019 году этот вид встречался редко в обеих системах управления. Didymella pinodella значительно варьировала по частоте в органических полях в зависимости от года (от 15 до 51%), но стабильно была низкой в традиционных полях (≤ 6%) (Таблица 4).

Таблица 4 Вариация частот выделения (%) восьми наиболее распространенных видов грибов, выделенных из корней конских бобов, разделенных по году отбора проб и системе управления.

Средние значения в столбце (для каждого вида по годам), за которыми следуют разные буквы, указывают на достоверные различия (P < 0,05) в частотах выделения отдельных видов между системами управления и годами (множественные сравнения скорректированных по Тьюки наименьших средних квадратов). ns = Недостоверно.

Частоты выделения F. avenaceum, F. tricinctum и F. culmorum значительно варьировали по годам, причем два последних вида обычно встречались реже в обеих системах управления (от 11 до 37% для F. avenaceum против от 2 до 21% для F. tricinctum и от 2 до 16% колонизированных корней для F. culmorum). Fusarium equiseti выделялся с низкой частотой в обеих системах возделывания (2–16%) (Таблица 4), тогда как представители FOSC и FSSC были обычны по частоте выделения по годам и между системами управления (Таблица 4).

Распространенность патогенов, т.е. процент полей, на которых встречались патогены, следовала той же закономерности, что и частоты выделения (Рисунок 5B). По годам F. redolens и D. pinodella были более распространены (P=0,0018) в органических полях (91% для F. redolens и 77% для D. pinodella) по сравнению с традиционными полями (74% для F. redolens и 30% для D. pinodella) (Рисунок 5B и Таблица 5). Присутствие F. redolens было значительно ниже в традиционных полях в 2016 и 2019 годах, тогда как в 2017 и 2018 годах показатели распространенности F. redolens в органических и традиционных полях были более сходными (Таблица 5). Закономерности распространенности D. pinodella были более изменчивыми. Преимущественно встречаясь в органических системах, этот вид демонстрировал умеренные или высокие показатели распространенности по годам — от 63% (2018) до 93% (2017). В традиционных системах наибольший показатель распространенности D. pinodella наблюдался в 2017 году (47%), а наименьший также в 2018 году (14%) (Таблица 5).

Таблица 5 Вариация распространенности (% полей) восьми наиболее распространенных видов грибов, выделенных из корней конских бобов, разделенных по году отбора проб и системе управления.

Средние значения в столбце (для каждого вида по годам), за которыми следуют разные буквы, указывают на достоверные различия (P < 0,05) в показателях распространенности отдельных видов между системами управления и годами (множественные сравнения скорректированных по Тьюки наименьших средних квадратов). ns = Недостоверно.

Хотя F. avenaceum и F. tricinctum выделялись из корней, собранных с традиционных полей, чаще, общие показатели распространенности этих видов достоверно не различались между системами управления (Рисунок 5B). Распространенность F. culmorum была достоверно выше в традиционных полях (63%), чем в органических (38%), что соответствует наблюдениям по частотам выделения.

Для представителей FOSC и FSSC наблюдалась некоторая вариабельность доли положительных полей, сходная с частотами выделения, но эти различия не были достоверными между системами управления по годам (Рисунок 5B) или в течение какого-либо одного года (Таблица 5). Представители FOSC стабильно обнаруживались более чем на 80% полей. Доля полей, положительных по FSSC, варьировала от 64 до 93%. Показатели распространенности F. equiseti варьировали от 19 до 75% в зависимости от года и системы возделывания (Таблица 5).

Филогения

Филогенетический анализ, выполненный на основе последовательностей гена TEF1 альфа, позволил определить филогенетическое положение 35 изолятов FOSC и 33 изолятов FSSC, изученных в данном исследовании, по отношению к современным признанным видам в обоих видовых комплексах (Рисунки 6, 7). Как представители FOSC, так и FSSC сильно варьировали по морфологии, что отражалось в высокой генетической изменчивости, особенно для представителей FOSC. На основе однолокусной филогении 35 изолятов FOSC были распределены по всей кладе FOSC и принадлежали к 9 различным линиям. Наиболее многочисленная группа, состоящая из 17 изолятов, была помещена в линию F. libertatis. Вторая по численности группа, представленная 6 изолятами, не кластеризовалась четко ни с одним из недавно описанных видов внутри FOSC. Они были наиболее близки к ранее определенной специальной форме F. oxysporum conglutinans (NRRL 36364). Результаты топологии дерева TEF1 альфа также выявили 4 изолята, соответствующих недавно установленным эпитипным образцам (Lombard и др., 2018), и 3 изолята были помещены в линии F. odoratissimum. Кроме того, отдельные изоляты были помещены в линии F. nirenbergiae, F. hodiae, F. fabacearum/F. calistephi, F. curvatum и F. commune (Рисунок 6).

Рисунок 6 Дерево максимального правдоподобия (RAxML), построенное на основе выравниваний частичных последовательностей гена TEF1 альфа изолятов комплекса видов Fusarium oxysporum (FOSC), использованных в данном исследовании. Изоляты (т.е. FOEP) выделены красным. Эпи- и экзотипные штаммы выделены жирным шрифтом и обозначены надстрочным индексом «T» (Lombard и др., 2018). Масштабная линейка указывает 0,009 ожидаемых замен на сайт. Дерево укоренено на F. udum (CBS 177.31).

Рисунок 7 Дерево максимального правдоподобия (RAxML), построенное на основе выравниваний частичных последовательностей гена TEF1 альфа изолятов комплекса видов Fusarium solani (FSSC), использованных в данном исследовании. Изоляты (т.е. FOEP) выделены красным. Эпи- и экзотипные штаммы выделены жирным шрифтом и обозначены надстрочным индексом «T» (O’Donnell и др., 2020; Geiser и др., 2021). Масштабная линейка указывает 0,05 ожидаемых замен на сайт. Дерево укоренено на F. thapsinum (H05557S1 DCPA).

33 изолята FSSC были распределены по трем различным линиям, все в пределах клады 3. Большинство изолятов (n=29) соответствовали F. pisi (syn. F. solani f. sp pisi), линии, недавно переименованной в Fusarium vanettenii (Geiser и др., 2021). Группа из 3 изолятов была помещена в линию Fusarium solani sensu stricto, и один изолят соответствовал F. breviconum (Рисунок 7).

Основные факторы, влияющие на частоту встречаемости патогенов и урожайность конских бобов

Общая путевая модель, полученная на основе пошаговой регрессии, показала хорошее соответствие данным как для органических, так и для традиционных полей (Дополнительная таблица 8). В органических полях урожайность отрицательно коррелировала с частотами D. pinodella (β = -0,42) и F. redolens (β = -0,40) и положительно — с частотой F. tricinctum в корнях конских бобов (β = 0,33). В традиционных полях были обнаружены слабые, но достоверные отрицательные корреляции между урожайностью и FOSC (β = -0,20) и F. culmorum (β = -0,21). Кроме того, урожайность положительно коррелировала с общим количеством осадков до посева (β = 0,27) и, в частности, с общим количеством осадков от посева до отбора корней (β = 0,48) для традиционных конских бобов. В целом эти переменные объясняли примерно 40% вариации урожайности в обеих системах управления (Дополнительная таблица 7).

Частоты F. redolens в обеих системах управления положительно коррелировали с количеством дней с температурой ниже нуля в марте (т.е. более холодными условиями во время посева и появления всходов: коэффициенты путевого анализа для органической/традиционной системы, β = 0,44/0,50) и средней температурой, измеренной за период от посева до отбора корней (β = 0,62/0,42). В соответствии с этой закономерностью, в органических полях частоты F. redolens отрицательно коррелировали со средней температурой за две недели до посева (β = -0,30). Кроме того, с этим патогеном ассоциировалась частота злаковых за пять лет до отбора проб (β = 0,24) и суглинистые почвы (β = 0,22). В совокупности эти переменные объясняли 55% и 25% вариации частот F. redolens в органических и традиционных системах соответственно (Таблица 6 и Дополнительная таблица 7).

Таблица 6 Сводка результатов путевого анализа, показывающая основные факторы окружающей среды и истории севооборота, влияющие на численность (частоты выделения) основных видов грибов в корнях органически (Org.) и традиционно (Conv.) выращенных конских бобов.

Положительные корреляции обозначены знаком «+» и указывают на увеличение частот выделения вида гриба. Отрицательные корреляции обозначены знаком «–». Исходные данные путевого анализа со стандартизованными коэффициентами путевого анализа приведены в Дополнительной таблице 7.

FOSC в обеих системах управления положительно коррелировал с песчаными, слабокислыми почвами (β = 0,52/0,43). В органических полях частоты FOSC положительно коррелировали с количеством дней с температурой ниже 5°C через две недели после посева (β = 0,46), общим количеством осадков от посева до двух недель после (β = 0,21) и средней температурой от посева до отбора корней (β = 0,24). Таким образом, влажные и более холодные условия до появления всходов, за которыми следовали более высокие температуры в течение основного вегетационного периода, благоприятствовали этому комплексу патогенов в органических полях, аналогично тому, что наблюдалось для F. redolens. В традиционных полях, помимо корреляции с песчаными почвами, частоты FOSC благоприятствовали более высокие температуры в начале года (с января до посева; β = 0,30). Вместе эти переменные объясняли 46% и 26% общей дисперсии FOSC в органических и традиционных полях соответственно (Таблица 6 и Дополнительная таблица 7).

Аналогично F. redolens и FOSC в органических системах, более холодные условия во время посева и/или появления всходов положительно коррелировали с частотами FSSC (в традиционной системе: положительная корреляция с количеством дней с температурой ниже нуля в марте, β = 0,32; в органической системе: отрицательная корреляция со средними температурами с января до посева, β = -0,32). Анализ также показал, что низкое количество осадков в период появления всходов (от посева до 2 недель после; β = -0,28) и выращивание конских бобов на глинистых почвах (β = 0,31) усиливали колонизацию корней FSSC в традиционных, но не в органических полях. Вместе эти переменные объясняли 10% и 34% общей дисперсии FSSC в органических и традиционных полях соответственно (Таблица 6 и Дополнительная таблица 7).

Для F. tricinctum 11% дисперсии в органических полях объяснялось отрицательной корреляцией с количеством дней с температурой ниже 5°C за две недели до посева (β = -0,33), т.е. более теплые условия до посева благоприятствовали ему. В традиционных системах этот эффект был противоположным (β = 0,34). Кроме того, меньшее количество осадков за две недели до посева (β = 0,23) объясняло 20% вариации данных по колонизации корней этим видом (Таблица 6 и Дополнительная таблица 7).

Частоты F. culmorum в обеих системах управления отрицательно коррелировали со средней температурой, измеренной за период от посева до отбора корней (β = -0,28/-0,49). Только в традиционных полях также наблюдалась отрицательная корреляция частот F. culmorum с общим количеством осадков за 4 недели до посева (β = -0,27) и от посева до отбора корней (β = -0,38), т.е. более холодные и сухие условия благоприятствовали этому патогену. Вместе эти переменные объясняли 11% и 18% общей дисперсии F. culmorum в органических и традиционных полях соответственно (Таблица 6 и Дополнительная таблица 7).

Частоты F. avenaceum и F. equiseti не удалось связать ни с какими факторами окружающей среды или историей возделывания в традиционных системах. В органических системах частоты выделения обоих видов отрицательно коррелировали с общей температурой между посевом и отбором корней (F. avenaceum/F. equiseti; β = -0,31/-0,27). Кроме того, F. equiseti отрицательно коррелировал с общим количеством осадков через две недели после посева (β = -0,27; как FSSC) и положительно — с частотой злаковых за предшествующие пять лет (β = 0,30), аналогично F. redolens. Эти переменные вместе объясняли 9% и 18% вариации данных по F. avenaceum и F. equiseti соответственно (Таблица 6 и Дополнительная таблица 7).

Didymella pinodella в органических полях положительно коррелировала с частотами холодостойких зернобобовых и мелкосемянных бобовых за предшествующие пять лет до отбора проб (β = 0,47) и клевера и люцерны за тот же период (β = 0,31). И наоборот, в традиционных системах частоты злаковых за предшествующие пять лет до отбора проб отрицательно влияли на колонизацию корней D. pinodella (β = -0,45). Кроме того, частоты D. pinodella отрицательно ассоциировались с количеством дней с температурой ниже нуля в марте (традиционная система: β = -0,47) и количеством дней с температурой ниже нуля за 2 недели до посева (органическая система: β = -0,27), т.е. противоположно F. redolens и FOSC. В традиционных системах частоты D. pinodella также положительно коррелировали с общим количеством осадков в течение 14 дней после посева (β = 0,44), но отрицательно — с общим количеством осадков от посева до отбора корней (β = -0,42), т.е. более теплые и влажные условия во время посева/появления всходов, за которыми следовали более сухие вегетационные сезоны, благоприятствовали этому патогену в традиционных полях. Модель объясняла 33% и 37% вариации вида в органической и традиционной системе соответственно (Таблица 6 и Дополнительная таблица 7).

Частота встречаемости корневой гнили в целом была низкой в обеих системах управления, особенно в 2017 и 2019 годах, когда количество осадков перед посевом было низким, за чем следовали сухие вегетационные сезоны. Среди 14 идентифицированных видов Fusarium и двух видов Didymella, комплексы видов F. oxysporum (FOSC) и F. solani (FSSC), F. redolens и F. avenaceum присутствовали на 82–94% полей и были наиболее многочисленными, составляя 74% всех выделенных изолятов. Реже встречающиеся виды Fusarium включали F. tricinctum, F. culmorum и F. equiseti. Вид D. pinodella встречался с умеренной численностью в органических полях, но был значительно реже в традиционных полях. Fusarium redolens также чаще встречался в корнях из органических полей по сравнению с традиционными. Напротив, F. avenaceum, F. tricinctum и F. culmorum чаще встречались в традиционно управляемых полях. Корни конских бобов колонизировались FOSC, FSSC и F. equiseti со сходной частотой в обеих системах управления.

Не было различий в составе или частотах (% колонизированных корней) видов грибов в симптоматичных и бессимптомных корнях конских бобов. Также не было влияния системы управления (органическая vs традиционная) на спектр выделенных патогенов. Эффекты систем возделывания были тесно связаны с различиями в истории севооборотов, поскольку традиционные системы в большинстве случаев были лишены бобовых как минимум в течение пяти лет. История севооборота влияла на частоты выделения ряда видов.

Низкий уровень симптомов корневой гнили, наблюдаемый на некоторых полях, мог быть обусловлен другими факторами, не оцененными в данном исследовании. Это могло включать присутствие других патогенов, таких как виды Pythium или Rhizoctonia (Esmaeili Taheri и др., 2017; Chatterton и др., 2019; Wille и др., 2019), и/или неблагоприятные абиотические свойства почвы, такие как повышенное содержание Fe и Mn в почве, которые являются сопутствующими факторами в развитии корневой гнили (Nayyar и др., 2009). Почвенные патогены должны достичь пороговой популяции внутри корня, прежде чем вызывать видимые симптомы болезни (Gu и др., 2022), и культуральные методы не отражают плотности патогенов в корнях. Кроме того, данный корень часто колонизируется несколькими видами грибов одновременно, и конкурентные взаимодействия могли играть роль в общей низкой выраженности симптомов. Например, ранее мы показали, что совместное присутствие F. equiseti и высокоагрессивных штаммов F. avenaceum и D. pinodella в корнях гороха может почти полностью нейтрализовать вредоносное воздействие этих патогенов (Šišić и др., 2017). Аналогично, другие полезные члены ассоциированных с корнями микробных сообществ, такие как арбускулярные микоризные грибы, также известны своей способностью снижать биотические стрессы (Wille и др., 2019). Неизвестно, в какой степени такие взаимодействия играли роль в выраженности симптомов. Это можно было бы оценить, например, с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qPCR). Хотя qPCR-анализы, нацеленные на все основные виды Fusarium, идентифицированные в этом исследовании, включая qPCR для обнаружения и количественной оценки D. pinodella, были недавно разработаны (Zitnick-Anderson и др., 2018; Šišić и др., 2022), эти анализы были недоступны на момент начала данного исследования. Это исследование создает прочную основу для дальнейшего анализа характера взаимодействий между основными выделенными видами грибов, поскольку успех qPCR зависит от предварительного знания целевой популяции патогенов. Несмотря на ограничения, связанные с использованием культуральной идентификации в нашем исследовании, в совокупности наши результаты указывают на общую высокую толерантность конских бобов к основным патогенам корневых гнилей зернобобовых, которые являются обычной частью корневой микрофлоры этой культуры.

Отсутствие четкой связи между частотой встречаемости корневой гнили и основными патогенами, идентифицированными в этом исследовании, а также между частотой встречаемости корневой гнили и урожайностью конских бобов согласуется с предыдущими сообщениями, указывающими на способность ассоциированных с бобовыми D. pinodella и видов Fusarium (Rodriguez и др., 2009; Šišić и др., 2018b; Šišić и др., 2022) инфицировать различных хозяев без проявления видимых симптомов корневой гнили. Тем не менее, путевой анализ показал значительные отрицательные корреляции D. pinodella и F. redolens с урожайностью в органических системах и значительные отрицательные эффекты FOSC и F. culmorum на урожайность в традиционных системах. Эти результаты согласуются с гипотезой о том, что редко существуют нейтральные биологические взаимодействия (Schulz и Boyle, 2005). Таким образом, бессимптомные инфекции растений, вероятно, являются результатом взаимно сбалансированного антагонизма между защитной системой растения и факторами вирулентности патогена (Schulz и Boyle, 2005). Положительная ассоциация частот патогенов со снижением урожайности в этом исследовании может отражать необходимость больших затрат со стороны конских бобов для поддержания сбалансированного антагонизма с вышеупомянутыми патогенами (т.е. при отсутствии или низких уровнях корневой гнили), что приводит к снижению урожайности. Мы недавно продемонстрировали, что D. pinodella высокоагрессивна на горохе, вызывая симптомы и снижение биомассы. Напротив, она может колонизировать корни пшеницы без проявления видимых симптомов болезни, одновременно снижая биомассу пшеницы (Šišić и др., 2022). Это первый случай, когда преимущественно бессимптомные корневые инфекции, вызываемые этим патогеном, по-видимому, отрицательно ассоциируются с урожайностью конских бобов. Тот факт, что эта отрицательная корреляция наблюдалась только в органических системах, является следствием различий в истории севооборотов между системами управления, поскольку этот патоген был неразрывно связан с частотой бобовых в севообороте, которые составляли только около 5% культур в традиционных полях по сравнению с 26% культур в органических полях (Рисунок 4 и Дополнительная таблица 5).

Fusarium redolens часто выделяется из больных корней различных зернобобовых культур, однако его роль в комплексе корневых гнилей до конца не изучена. Например, Booth (1971) сообщил, что этот патоген широко распространен в умеренных регионах, вызывая выпревание, увядание и корневые гнили на различных небобовых и бобовых культурах, включая горох и конские бобы. Более позднее исследование установило F. redolens как важный и очень агрессивный патоген корневой гнили гороха в северной Франции, вызывающий сходные повреждения, что и F. solani f. sp. pisi (Gibert и др., 2022). Напротив, Persson и др. (1997) и, позднее, Safarieskandari и др. (2020) обнаружили, что F. redolens является в целом слабым патогеном корневой гнили на основе анализов патогенности in vitro, несмотря на его частое выделение из корней симптоматичного полевого гороха и чечевицы (Chatterton и др., 2019). В нашем исследовании, однако, возможно, что бессимптомные инфекции F. redolens могли оппортунистически влиять на урожайность, когда растения подвергались стрессу из-за холодных условий на ранних стадиях роста культуры, за которыми следовали теплые и сухие условия. Существует необходимость более точно охарактеризовать взаимодействия этого патогена, урожайности конских бобов и переменных окружающей среды, включая другие виды грибов. Это может быть особенно важно, поскольку F. redolens также патогенен для злаковых культур (Esmaeili Taheri и др., 2011; Yegin и др., 2017; Gebremariam и др., 2018), которые являются обычной частью севооборотов.

В отличие от отрицательных эффектов D. pinodella и F. redolens на урожайность, более высокая численность F. tricinctum в корнях конских бобов положительно ассоциировалась с урожайностью конских бобов в органических системах. Хотя этот вид часто выделяется из бобовых культур (Šišić и др., 2018b; Chatterton и др., 2019), F. tricinctum в основном ассоциируется с комплексом фузариозной колосовой гнили (FHB) мелкозерновых злаковых культур в Европе и Северной Америке (Uhlig и др., 2007). Наше предыдущее исследование (Šišić и др., 2018b) показало, что этот вид является лишь слабым патогеном на горохе, где колонизация корней даже приводила к увеличению биомассы гороха. Напротив, Yan и Nelson (2020) недавно сообщили, что F. tricinctum является важным патогеном корневой гнили сои. Однако, учитывая наблюдаемые положительные эффекты на урожайность, рекомендуются дальнейшие исследования для лучшего понимания роли этого вида в комплексе корневых гнилей конских бобов.

В отличие от органических систем, более высокая численность FOSC и F. culmorum в корнях конских бобов приводила к снижению урожайности в традиционных полях, что, возможно, отражает различия в общих свойствах почвы, обусловленные системой возделывания. Фузариозная корневая гниль конских бобов, вызываемая несколькими видами Fusarium, включая F. culmorum, и, в частности, фузариозное увядание, вызываемое F. oxysporum, относятся к числу наиболее разрушительных болезней этой культуры в мире (Sillero и др., 2010; Lv и др., 2020). Однако важно отметить, что, в отличие от органических систем, урожайность конских бобов в традиционных системах в меньшей степени зависела от патогенов и в большей степени — от общего количества осадков.

Влияние истории севооборота на основные ассоциированные с корнями виды грибов

Почти никакие бобовые не выращивались в течение 5–11 лет, предшествовавших обследованию традиционных конских бобов в этом исследовании, тогда как зернобобовые (в основном горох и конские бобы), а также клевер и люцерна почти всегда присутствовали в течение этого периода в обследованных органических полях. Это различие в истории севооборотов было сильно коррелировано с присутствием D. pinodella, которая была повсеместно распространена в органических полях, но встречалась гораздо реже или даже отсутствовала в традиционных полях. Bainard и др. (2017) сообщили о сходных результатах: интенсификация севооборотов с горохом приводила к значительному увеличению численности этого патогена в почве и корнях гороха.

Вероятно, что более высокая частота бобовых в органических севооборотах также способствовала более высокой численности F. redolens в органических системах по сравнению с традиционными, поскольку ранее было показано, что численность этого патогена в почве значительно увеличивается после интенсификации севооборотов с зернобобовыми (Bainard и др., 2017). Однако положительная корреляция этого патогена с частотой злаковых в органических системах не является удивительной, поскольку F. redolens также является патогеном пшеницы (Esmaeili Taheri и др., 2011; Gebremariam и др., 2018) и ячменя (Yegin и др., 2017).

Более высокая относительная численность F. avenaceum, F. tricinctum и F. culmorum в традиционно выращенных конских бобах, вероятно, связана с общей более высокой долей злаковых в традиционных севооборотах, несмотря на отсутствие четких корреляций. В большинстве традиционных полей злаковые выращивались от трех до пяти раз за пять лет, предшествовавших посеву конских бобов. Эти три вида являются основными патогенами мелкозерновых злаковых и кукурузы, часто ассоциированными с гнилями колоса, стебля и корней и ответственными за предуборочное загрязнение микотоксинами (Bottalico и Perrone, 2002; Pfordt и др., 2020). Среди трех видов F. avenaceum является наиболее важным и широко распространенным. Это оппортунистический патоген, особенно в отсутствие органического вещества (Baćanović-Šišić и др., 2018), и основной возбудитель корневой гнили гороха и чечевицы в Канаде (Esmaeili Taheri и др., 2016; Chatterton и др., 2019) и корневой гнили гороха в США (Chittem и др., 2015) за последние 20 лет. В Европе F. avenaceum часто выделяется из больных корней гороха, но обычно с умеренной частотой (Persson и др., 1997; Pflughöft и др., 2012; Baćanović-Šišić и др., 2018; Šišić и др., 2019).

Влияние условий окружающей среды на основные идентифицированные виды грибов

Почвенно-климатические условия, по-видимому, были основными движущими факторами встречаемости большинства видов Fusarium, идентифицированных в этом исследовании. В частности, холодные условия во время посева и появления всходов и/или в течение вегетационного сезона благоприятствовали большинству доминирующих видов Fusarium, идентифицированных в этом исследовании. Эти условия ассоциировались с повышенной колонизацией корней F. redolens, F. solani и F. culmorum в обеих системах управления, а также FOSC и F. equiseti в органических системах. Посев в холодную почву удлиняет период появления всходов, благоприятствуя раннему инфицированию растений этими патогенами (Naseri и Marefat, 2011). Хотя виды Fusarium могут инфицировать своих хозяев на всех стадиях роста, предыдущие исследования показали, что время инфицирования играет решающую роль в степени тяжести корневой гнили и снижении урожайности (Papavizas, 1974; Šišić и др., 2017; Navas-Cortés и др., 2020). Например, Šišić и др. (2017) показали, что вредоносное действие F. avenaceum на здоровье корней и биомассу гороха сильно зависело от времени инокуляции патогена. При инокуляции во время посева F. avenaceum вызывал сильное увядание, приводящее к 83% потере биомассы гороха по сравнению с неинокулированным контролем. Напротив, инокуляция через пять дней после посева гороха приводила к умеренной тяжести корневой гнили со значительно сниженными отрицательными эффектами на биомассу гороха (-14%). Поэтому энергичные семена, вероятно, быстро проходят стадию высокочувствительных всходов, снижая общие риски повреждения Fusarium. Но также более высокие температуры, например, жаркая погода после посева и/или в период от посева до отбора корней, могут благоприятствовать корневым инфекциям, например, F. redolens, который был более выражен в обеих системах управления в жаркие и сухие сезоны. Противоположное наблюдалось для F. culmorum в обеих системах управления и F. avenaceum и F. equiseti в органических системах: их колонизация корней благоприятствовалась более прохладным вегетационным сезоном. Эффекты осадков были сильно вариабельны и в основном специфичны для системы управления и вида Fusarium. Хотя виды Fusarium способны адаптироваться к различным диапазонам условий окружающей среды, конкурентное преимущество каждого вида в комплексе корневых гнилей конских бобов будет варьировать в зависимости от специфических для участка почвенно-климатических условий (Yergeau и др., 2009). Кроме того, абиотический стресс растений (т.е. защитная реакция культуры) оказывает важное влияние на восприимчивость конских бобов к инфекциям Fusarium.

В отличие от видов Fusarium, более теплые условия во время посева/появления всходов благоприятствовали D. pinodella в обеих системах управления. Кроме того, хотя этот вид редко встречался в традиционных системах, частоты D. pinodella положительно коррелировали с более теплыми и влажными условиями во время посева/появления всходов, за которыми следовали более сухие вегетационные сезоны. Положительный эффект более сухих условий на колонизацию корней D. pinodella и особенно высокая частота встречаемости этого патогена в 2019 году — самом засушливом году отбора проб в этом исследовании — противоречат тому, что сообщалось для системы D. pinodella–горох, где инфекции преимущественно благоприятствуют влажные и сырые условия в течение основного вегетационного периода (Bretag и др., 2006; Esmaeili Taheri и др., 2016). Эти результаты показывают, что коротких периодов влажных условий достаточно для инфицирования этим патогеном, а также указывают на его оппортунистическую природу, когда абиотический стресс растений (например, недостаток осадков) может усилить процесс колонизации после возникновения первичных инфекций.

Наше наблюдение, что частота FOSC положительно коррелировала с песчаными почвами с более низким pH, подтверждает предыдущие сообщения о том, что песчаные почвы и более низкий pH более благоприятны для этого патогена и способствуют увеличению частоты корневой гнили и увядания на ряде различных культур, включая нут, банан, лен, гвоздику, арбуз, томат и бархатцы (Scher и Baker, 1980; Amir и Alabouvette, 1993; Singh и др., 2017; Orr и Nelson, 2018; Saeedi и Jamali, 2021). Некоторые из этих исследований также показали, что суглинистые и глинистые почвы и/или повышение pH почвы часто подавляли развитие фузариозного увядания. Мы также обнаружили слабую, но статистически значимую ассоциацию F. redolens с органическими суглинистыми почвами в этом исследовании. Saeedi и Jamali (2021) недавно сообщили, что F. redolens является очень агрессивным патогеном нута в Иране, где F. oxysporum доминировал на песчаных почвах, тогда как F. redolens был сильно коррелирован с низким содержанием песка и органического вещества, среди прочих факторов. Кроме того, положительная корреляция между частотами FSSC в традиционной системе и суглинисто-глинистыми почвами с обычно высоким содержанием SOM (т.е. поля в почвенном кластере 3) показывает, что представители FSSC являются высококонкурентными сапрофитами.

Генетическое разнообразие среди изолятов F. oxysporum и F. solani

Наблюдение, что представители FOSC и FSSC являются важными компонентами комплекса корневых гнилей конских бобов как в органических, так и в традиционных полях, согласуется со многими предыдущими исследованиями (Chittem и др., 2015; Esmaeili Taheri и др., 2016; Šišić и др., 2018a; Šišić и др., 2018b; Chatterton и др., 2019). Широкое распространение FOSC и FSSC в диапазоне почвенных и экологических условий, наблюдаемое в этом исследовании, указывает на высокую адаптивность обоих видовых комплексов к ряду почвенно-климатических и экологических условий, что, в свою очередь, может указывать на высокое генетическое разнообразие. Однако высокая генетическая изменчивость среди 35 изолятов F. oxysporum от одного хозяина, наблюдаемая в этом исследовании, стала неожиданностью. За исключением линий F. curvatum, F. nirenbergiae, F. oxysporum и F. fabacearum, которые ранее ассоциировались либо с конскими бобами, либо с другими бобовыми, остальные пять линий, включая наиболее многочисленную F. libertatis (17/35 изолятов), ранее не были связаны ни с одним бобовым хозяином. Необходим дальнейший анализ для определения их роли в комплексе корневых гнилей конских бобов.

В отличие от FOSC, 29 из 33 проанализированных изолятов FSSC соответствовали F. pisi (syn. F. solani f. sp. pisi; Fusarium vanettenii), группа из 3 изолятов была помещена в линию Fusarium solani sensu stricto, и один изолят соответствовал F. breviconum. Эти результаты подтверждают широкую ассоциацию F. pisi с различными бобовыми и его способность занимать разнообразные экологические ниши (Šišić и др., 2018a). Совсем недавно Safarieskandari и др. (2020) продемонстрировали высокий уровень агрессивности F. pisi по отношению к конским бобам. Также важно отметить, что, хотя филогенетический анализ в целом подтвердил хорошую разрешающую способность локуса TEF1 альфа у Fusarium, для некоторых линий внутри FOSC наблюдалась низкая бутстреп-поддержка. Однако эти результаты были ожидаемыми из-за однолокусного анализа и согласуются с результатами топологии дерева TEF1 альфа, сообщенными для FOSC (Lombard и др., 2018) и для FSSC (Šišić и др., 2018a; Geiser и др., 2021). В настоящее время ведется работа по получению дополнительных последовательных данных из большего числа локусов, а также тестов на агрессивность для лучшего понимания генетической вариации и роли собранных изолятов в комплексе корневых гнилей конских бобов.

Это четырехлетнее обследование представляет первую сравнительную документацию по распространенности и частоте видов Fusarium и Didymella, ассоциированных с корнями конских бобов в органических и традиционных полях Германии. Охватывая широкий диапазон почвенно-климатических условий и историй полей при традиционных и органических системах производства, стало возможным разработать предположения об основных движущих силах, влияющих в настоящее время на сообщество патобиома конских бобов. Почвенно-климатические условия были основными движущими силами сообществ Fusarium, тогда как D. pinodella в первую очередь зависела от присутствия зернобобовых в недавней истории севооборота. Это привело к доминированию этого патогена в органических системах, почти безусловно, из-за более высокой частоты бобовых в органических севооборотах. Необходимо изучить роль F. libertatis и других идентифицированных представителей FOSC, которые ранее не были связаны с корневой гнилью зернобобовых. Это исследование показало, что некоторые основные патогены корневых гнилей зернобобовых могут бессимптомно колонизировать корни конских бобов, как ранее сообщалось для других культур (Šišić и др., 2018b; Šišić и др., 2022). Исследование показало, что урожайность конских бобов в органических системах, по-видимому, подвергалась влиянию бессимптомных корневых инфекций D. pinodella и F. redolens, тогда как урожайность в традиционных системах в большей степени зависела от общего количества осадков в течение основного вегетационного периода. Как описано во введении, новая стратегия ЕС в отношении белковых культур побудила многих традиционных фермеров с 2012 года внедрять зернобобовые, и наше обследование показывает, что большинство традиционно выращиваемых конских бобов выращивались впервые за многие годы. Однако общее увеличение производства зернобобовых в традиционных условиях, вероятно, изменит их санитарное состояние, как это уже наблюдалось в Канаде (Bainard и др., 2017; Niu и др., 2018).

Дополнительный материал к этой статье можно найти онлайн по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.1009906/full#supplementary-material

Šišić A, Baćanović-Šišić J, Schmidt H and Finckh MR (2022) Farming system effects on root rot pathogen complex and yield of faba bean (vicia faba) in Germany. Front. Plant Sci. 13:1009906. doi: 10.3389/fpls.2022.1009906

Перевод статьи «Farming system effects on root rot pathogen complex and yield of faba bean (vicia faba) in Germany» авторов Šišić A, Baćanović-Šišić J, Schmidt H and Finckh MR., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык

Фото: Designed by Freepik