Как органическое земледелие и климатический стресс «закаляют» почвенные бактерии и помогают расти пшенице

Эффекты стрессовых факторов, связанных с изменением климата и методами ведения сельского хозяйства, на микроорганизмы часто изучаются по отдельности, и до сих пор не установлено, как эти факторы влияют на почвенный микробиом и, следовательно, на характеристики роста растений. Целью данного исследования было понять, как исторические климатические условия и методы земледелия, которым подвергались почвенные микроорганизмы, могут влиять на рост проростков пшеницы и связанные с ними бактериальные сообщества.

Мы собрали почву с органических и традиционных (конвенциональных) полей с разной историей климатических условий, чтобы выделить микроорганизмы для инокуляции семян пшеницы в условиях культивирования на агаре. В течение 8-дневного периода роста мы отслеживали всхожесть и время прорастания, а также надземную биомассу проростков и связанные с ними бактериальные сообщества. Результаты показали положительное взаимодействие между традиционными методами земледелия и обычными климатическими условиями, способствующее более быстрому и высокому проценту всхожести. Мы демонстрируем, что экстракты почвенных микроорганизмов из органического земледелия, имеющие опыт воздействия будущего климата, значительно увеличивали надземную биомассу, а также разнообразие бактериальных сообществ, ассоциированных с проростками, по сравнению с другими методами лечения. Эти данные подтверждают идею о том, что органические методы ведения сельского хозяйства не только смягчают неблагоприятные последствия изменения климата, но и способствуют разнообразию бактерий, связанных с проростками.

Частота и интенсивность экстремальных погодных явлений возрастали на протяжении последних десятилетий из-за глобальных климатических изменений и, по прогнозам, будут продолжать увеличиваться в будущем (IPCC, 2021). Как следствие, экстремальные засушливые условия привели к значительному снижению урожайности сельскохозяйственных культур — от 50 до 70% (Eckstein et al., 2020). Это снижение производства сельскохозяйственных культур создает проблему удовлетворения растущего спроса на производство продовольствия, которое, как ожидается, увеличится как минимум на 70% к 2050 году (FAO, 2009). Интенсивное ведение сельского хозяйства, например, традиционное (конвенциональное) земледелие, предполагает использование высоких доз химикатов и удобрений для увеличения производства сельскохозяйственных культур, но может вызывать деградацию земель и потерю биоразнообразия (Foley et al., 2005; Powers and Jetz, 2019). Органические методы ведения сельского хозяйства не применяют синтетические удобрения или пестициды, что может приносить пользу общему здоровью экосистемы (Bonilla et al., 2012; Lori et al., 2017). Глобальное изменение климата, вероятно, усилит негативное воздействие интенсификации сельского хозяйства на различные функции экосистем (Sünnemann et al., 2021). Однако мы ограниченно понимаем, как сельскохозяйственные поля при традиционной и органической практике земледелия могут противостоять экстремальным погодным условиям и, таким образом, обеспечивать производство продовольствия.

Почвенные и ассоциированные с растениями микроорганизмы могут продуцировать разнообразные биологические продукты, способные вносить значительный вклад в устойчивость сельскохозяйственных культур к стрессу. Климатические экстремумы и методы ведения сельского хозяйства могут оказывать серьезное влияние на микроорганизмы (Azarbad, 2022). Применение высоких доз химикатов и минеральных удобрений в традиционном земледелии, как было показано, оказывает значительное негативное воздействие на характеристики почвы (Dubey et al., 2019), что может неблагоприятно сказываться на почвенных микробиомах (Lupatini et al., 2017). Например, сообщалось, что традиционное земледелие негативно влияет на состав и функционирование почвенного микробного сообщества, приводя к снижению микробного разнообразия и биомассы (de Vries et al., 2012). С другой стороны, было показано, что сельскохозяйственные угодья, управляемые органическим способом, имеют лучшие абиотические компоненты почвы, включая более высокое содержание органического вещества и водоудерживающую способность почвы (Lotter et al., 2003), которые важны для роста и функционирования микроорганизмов. Соответственно, предыдущие исследования сообщали об увеличении микробного разнообразия почвы (Hartmann et al., 2015) и обильности (Lori et al., 2017) при данной практике ведения сельского хозяйства.

В контексте микробиомов растений полезные микроорганизмы могут поддерживать растения-хозяева, способствуя усвоению питательных веществ, подавляя патогены и защищая от сложных экологических условий (Li et al., 2019; Azarbad, 2022), таким образом напрямую влияя на продуктивность сельского хозяйства (Schmidt et al., 2019). Изучая 40 различных сельскохозяйственных полей, Ricono et al. (2022) сообщили, что органическое земледелие увеличивает разнообразие и обилие полезных микроорганизмов в корневых микробиомах озимой пшеницы по сравнению с традиционным земледелием. В другом примере было показано, что органическое земледелие поддерживает более разнообразную, сложную и стабильную микробную сеть (на основе метагеномного секвенирования), чем традиционное земледелие, в филлосферных микробиомах сахарного тростника (Khoiri et al., 2021). Однако, поскольку влияние методов ведения сельского хозяйства и последствия изменения климата на почвенные и растительные микроорганизмы часто изучаются по отдельности, пока не ясно, как эти факторы независимо или интерактивно влияют на характеристики роста растений, а также на разнообразие и состав ассоциированных микроорганизмов.

Цель данного исследования состояла в том, чтобы понять, как исторический климат и методы земледелия, которым подвергались почвенные микроорганизмы, могут влиять на характеристики роста проростков пшеницы и их бактериальные сообщества. Для достижения этой цели мы собрали образцы почвы с экспериментальной установки Global Change Experimental Facility (GCEF). В 2014 году GCEF была создана как полевая исследовательская станция, расположенная в Центре экологических исследований им. Гельмгольца в Бад-Лаухштедте, Саксония-Анхальт, Германия (Schädler et al., 2019). Эта исследовательская станция является одним из крупнейших полевых экспериментов по оценке совместного воздействия потепления и измененных режимов выпадения осадков (в качестве сценария будущего климата), а также различных типов землепользования (таких как традиционное и органическое земледелие) на различные экосистемные процессы. Предыдущие исследования, проведенные на этом экспериментальном поле, позволили получить представление о влиянии прогнозируемых сценариев будущего изменения климата и различных методов ведения сельского хозяйства на питательную активность почвенных беспозвоночных и скорость почвенного дыхания (Siebert et al., 2020), на почвенный микробиом с точки зрения структуры сообщества (анализ фосфолипидных жирных кислот) и функционального разнообразия (использование углеродных субстратов) (Kostin et al., 2021). Например, Wahdan et al. (2021) показали, что органическая практика земледелия значительно увеличивала общее богатство арбускулярных микоризных грибов (AMF), ассоциированных с корнями пшеницы, в условиях будущего климата, что повышало доступность питательных веществ для растений. Таким образом, данный полевой эксперимент предоставляет уникальную возможность для изучения роли истории почвенного микробиома в формировании характеристик роста проростков пшеницы. После сбора почвы с полей органического и традиционного земледелия (история земледелия) в условиях современного и будущего климата (история климата) мы провели эксперимент, чтобы определить, какие условия земледелия и климата лучше с точки зрения почвенных микробиомов для улучшения роста проростков пшеницы. В частности, мы хотели ответить на следующие вопросы: могут ли почвенные микробиомы, отобранные разной историей земледелия и климата, влиять на ростовые признаки проростков пшеницы? И в какой степени история почвенных микробиомов формирует бактериальные сообщества проростков? Мы предположили, что микробиом из инокулюма, ассоциированного с почвой органического земледелия в условиях исторического климатического стресса, содержит большее разнообразие и полезных микроорганизмов, которые могут положительно влиять на характеристики роста проростков пшеницы. Эти цели были достигнуты путем анализа важных ростовых признаков проростков пшеницы, которые имеют ключевое значение для формирования всходов (скорость и время прорастания, а также надземная биомасса проростков), и бактериальных сообществ из инокулюма (почвенных микробных экстрактов) и проростков.

Отбор почвенных образцов

Мы воспользовались преимуществами GCEF, которая представляет собой крупный многолетний полевой эксперимент в Саксонии-Анхальт, Германия, предназначенный для оценки влияния глобальных изменений на различные экосистемные процессы в ряде типов землепользования и их интенсивностей. Подробная информация о GCEF доступна в работе Schädler et al. (2019). Это экспериментальное поле включает 50 участков (по 400 м² каждый), расположенных в 10 основных блоках (по 5 участков на блок). В каждом основном блоке создано пять различных типов землепользования, включая: (1) традиционное земледелие; (2) органическое земледелие; (3) интенсивно используемые пастбища с частым скашиванием; (4) экстенсивно используемые пастбища с умеренным скашиванием; и (5) экстенсивно используемые пастбища, используемые для умеренного выпаса овец. На полях традиционного земледелия севооборот включает озимый рапс, озимую пшеницу и озимый ячмень с использованием минеральных удобрений и пестицидов (подробнее см. Schädler et al., 2019). На традиционных полях азотное удобрение включает многократное внесение кальциево-аммиачной селитры (40–60 кг/га). Калий (K) восполняется из расчета 110 кг/га с использованием хлорида калия, а фосфор (P) вносится из расчета 30 кг/га в виде суперфосфата каждый год. На полях органического земледелия озимый рапс заменен бобовыми (чередование люцерны и белого клевера) для биологической фиксации азота (N). Кроме того, органические поля ежегодно получают 120 кг/га K в виде патентного калия и 45 кг/га P в виде фосфоритной муки. При органическом земледелии пестициды не применяются.

Половина основных блоков подвергается режиму будущего климата, спроектированному как средний сценарий на 2070–2100 годы, таким образом, что участки оборудованы мобильными крышами (высотой 5 м) и боковыми панелями вместе с системой орошения. На участках с будущим климатом количество осадков уменьшается примерно на 20% в летние месяцы и увеличивается примерно на 10% весной и осенью. Кроме того, укрытия и панели автоматически закрываются от заката до рассвета на этих участках, чтобы повысить температуру во все сезоны в ночное время до 2,5°C, со средним увеличением в течение года примерно на 0,6°C. Остальные блоки подвергаются современному климату. Климатические манипуляции в GCEF начались весной 2014 года. Образцы почвы были собраны в августе 2021 года с участков будущего и современного климата, связанных с органической и традиционной системами земледелия, представляющими различные истории стрессового воздействия на почву и микробиом (Рисунок 1A). Для обоих типов сельскохозяйственных полей предшествующей культурой на участках была озимая пшеница (RGT Reformed). Было собрано двадцать почвенных подобразцов (2 истории земледелия × 2 истории климата × 5 повторностей) (по 0,5–0,6 кг от каждой повторности) из поверхностного слоя почвы (глубина 0–15 см), перемешаны (для получения одного репрезентативного образца) и затем доставлены в лабораторию. Это дало примерно 3 кг свежей почвы для каждого типа истории почвы. Выбранные почвы имеют схожие типы и текстуру почв, но различаются по истории земледелия и климата. Все образцы почвы хранились во влажном и холодном состоянии (при 4°C) до начала эксперимента.

Рисунок 1 (A) Экспериментальное поле GCEF: было собрано 20 почвенных подобразцов с участков будущего и современного климата, связанных с органической и традиционной системами земледелия, представляющих различные истории стрессового воздействия на почву и микробиом (Изображение GCEF: Tricklabor Berlin). (B) Водорастворимые питательные вещества в почвенных суспензиях. Был проведен дисперсионный анализ (ANOVA) для проверки влияния различных историй земледелия (органическое vs. традиционное) и климата (будущий vs. современный) на водорастворимые питательные вещества, такие как общий азот (TNb), общий фосфор (TP) и калий (K).

Экстракция почвенного микробиома

Для каждого типа истории почвы микробные экстракции проводились путем смешивания 5 г почвы (взятой случайным образом из 3 кг свежей почвы) с 45 мл стерилизованного PBS-буфера в стерилизованной автоклавированием колбе Эрленмейера объемом 250 мл в течение одного часа на шейкере при скорости 150 об/мин. Затем почвенные суспензии переносили в 50-мл пробирки Falcon и помещали в центрифугу на 5 минут при 2000 об/мин для отделения микробной суспензии от почвенных частиц. Эта процедура повторялась четыре раза для каждого типа истории почвы, а затем микробные экстракты объединялись перед инокуляцией семян. По 1 мл из каждого из этих четырех микробных экстрактов немедленно отбиралось и хранилось при −20°C для последующего анализа (например, выделения ДНК и секвенирования). Ранее мы продемонстрировали, что такой метод микробной экстракции приводит к формированию микробных сообществ в почве до экстракции и в микробных суспензиях, сходных между собой (Giard-Laliberté et al., 2019), что также было показано в других исследованиях (Walsh et al., 2021). Для проверки водорастворимых почвенных питательных веществ почвенные суспензии были отправлены в компанию Eurofins Umwelt Nord GmbH (Гёттинген, Германия) для измерения общего азота (TNb), общего фосфора (TP) и калия (K) в качестве основных питательных веществ, используемых в GCEF. Кроме того, чтобы получить представление о том, какая доля бактерий может выживать и расти на агаровых средах (LB и R2A), мы приготовили серийное разведение из каждого почвенного экстракта, что позволило нам обнаружить и выделить различимые бактериальные колонии (на основе размера, цвета и формы каждой колонии). Затем мы культивировали и идентифицировали эти колонии на основе секвенирования по Сэнгеру гена 16S (LGC Genomics GmbH, Берлин, Германия). Эти результаты показаны на Дополнительном рисунке S1.

Экспериментальный дизайн

В этом исследовании использовались семена пшеницы (Triticum aestivum L.). Чтобы изолировать влияние почвенного микробного экстракта от воздействия эдафических и климатических факторов, мы выращивали семена в стерилизованных микроконтейнерах (Paungfoo-Lonhienne et al., 2010; Helletsgruber et al., 2017) в климатической камере. Для инокуляции семян пшеницы почвенными микробными экстрактами микроконтейнеры стерилизовали и заполняли 200 мл растительного агара Мурасиге-Скуга (1,1 г Мурасиге-Скуга от Duchefa, 5,5 г растительного агара на литр дистиллированной воды). Мы не проводили поверхностную стерилизацию семян перед микробной инокуляцией, поскольку хотели учесть возможные взаимодействия между исходным семенным микробиомом и микробиомом инокулюма, которые в конечном итоге формируют бактериальные сообщества проростков. По шесть семян помещали в стерильный микроконтейнер, где каждое семя обрабатывали 400 мкл почвенных микробных экстрактов, нанося жидкость пипеткой на семя и прилегающую область. Контрольные (неинокулированные) семена получали 400 мкл стерильного PBS-буфера. Таким образом, этот эксперимент включает 5 вариантов обработки (четыре почвенных микробных экстракта плюс PBS-буфер в качестве контроля). Объем 400 мкл был выбран на основе предварительного теста, в котором мы использовали различные количества воды, необходимые для прорастания семян в стерилизованных контейнерах без образования водяного слоя на поверхности агаровой среды. Стерильные микроконтейнеры помещали в климатическую камеру при контролируемых условиях: 16:8 ч (свет:темнота), 22–24°C и плотность потока фотонов 800 мкмоль·м⁻²·с⁻¹. Каждый вариант обработки был повторен 10 раз в рандомизированном дизайне (5 обработок × 10 повторностей = 50 контейнеров). Скорость прорастания и время прорастания измерялись в течение 6 дней. Скорость прорастания выражалась в процентах, где мы подсчитывали количество проросших семян в каждой обработке и делили на общее количество посаженных семян (6), умножали на 100. По окончании эксперимента (на 8-й день) растения аккуратно извлекали из контейнера, растительный агар удаляли, а семена и корни срезали стерильным скальпелем. Свежую массу надземной биомассы (образцы побегов) каждого проростка измеряли для отдельных растений в каждом микроконтейнере (Дополнительные данные S1). После измерений биомассы образцы побегов хранили при −20°C до выделения ДНК. Учитывая, что первые 8 дней после прорастания могут иметь ключевое значение для проростков пшеницы, поскольку они претерпевают значительные физиологические изменения, которые могут служить ранними индикаторами успешного укоренения на более поздней стадии развития, это время было выбрано для измерения надземной биомассы проростков.

Выделение ДНК, секвенирование ампликонов и обработка данных

Для выделения ДНК из проростков было случайным образом отобрано 5 повторностей (из 10) в каждой обработке, где образцы побегов всех проростков в каждом микроконтейнере измельчали в порошок с использованием жидкого азота в ступке с пестиком. ДНК выделяли из 0,1 г проростков или 1 мл раствора микробного экстракта с использованием фенол-хлороформного метода экстракции (Dellaporta et al., 1983). Это дало 25 образцов ДНК из проростков и 16 образцов из почвенных микробных экстрактов. Дополнительная информация о выделении ДНК представлена в работе Azarbad et al. (2018). Образцы ДНК были отправлены в LGC Genomics GmbH (Берлин, Германия) для подготовки библиотек и секвенирования на платформе Illumina MiSeq (парноконцевые прочтения). Для бактериального гена 16S рРНК участок V3–V4 амплифицировали с использованием праймеров 341F (CCTACGGGNGGCWGCAG) и 785R (GACTACHVGGGTATCTAAKCC). Для блокирования амплификации растительной ДНК и снижения содержания митохондриальной и хлоропластной ДНК во время амплификации использовались специфические пептидные нуклеиновые кислоты (PNA)-зажимы, как рекомендовано Fitzpatrick et al. (2018). Данные секвенирования анализировались в соответствии с процедурами, описанными Walsh et al. (2021). Сырые прочтения были обработаны с использованием биоинформатического конвейера на основе DADA2 версии 1.10.1 (Callahan et al., 2016) в программном обеспечении R. Кратко: последовательности праймеров были удалены, а прочтения были обрезаны до 250 и 200 п.н. для прямых и обратных прочтений соответственно (maxEE = c(2,2), maxN = 0, truncQ = 2, rm.phix = TRUE). Химерные последовательности были идентифицированы и удалены с помощью функции removeBimeraDenovo из DADA2. Для таксономической принадлежности полученных вариантов последовательностей ампликонов (ASV) был проведен наивный байесовский классификатор на основе базы данных SILVA v138. ASV, не отнесенные к типу (филуму), вместе с хлоропластными и митохондриальными прочтениями были удалены из набора данных. Перед дальнейшим анализом были применены следующие критерии фильтрации: образцы должны иметь более 1000 прочтений ASV, а любые ASV с менее чем пятью прочтениями в данном образце удалялись. Кроме того, любые ASV, обнаруженные только в одном образце, исключались из набора данных. Для расчета альфа-разнообразия данные были нормализованы на основе глубины секвенирования. Для бета-разнообразия мы нормализовали набор данных на основе относительной обильности ASV в каждом образце (Walsh et al., 2021).

Статистический анализ

Статистический анализ выполнялся с использованием программного обеспечения R (версия 4.4.2, The R Foundation for Statistical Computing). Был проведен дисперсионный анализ (ANOVA) для определения потенциального влияния истории земледелия и климата на питательные вещества в почвенных экстрактах, скорость и время прорастания, биомассу проростков и индекс разнообразия Шеннона для бактерий, учитывая как прямые, так и интерактивные эффекты. Мы провели анализ главных координат (PCoA) и тест Permanova (через функцию "adonis") для оценки влияния экспериментальных факторов на состав бактериальных сообществ почвенного микробного экстракта и проростков пшеницы. Наш анализ основывался на относительной обильности ASV с использованием несходства Брея–Кертиса. Для каждой истории земледелия и климата, чтобы определить, являются ли почвенные микробные экстракты более сходными с инокулированными проростками по сравнению с неинокулированными контрольными растениями, мы рассчитали несходство Брея–Кертиса для каждого экстракта и соответствующих растений и проверили значимость различий с использованием рангового теста Уилкоксона. Дополнительно мы сравнили количество общих и уникальных ASV между бактериальными сообществами инокулированных проростков и соответствующим инокулюмом (почвенными микробными экстрактами) с количеством общих и уникальных ASV между сообществами неинокулированных контрольных растений и тем же инокулюмом (Giard-Laliberté et al., 2019). Мы также использовали ANOVA для анализа влияния каждого экспериментального фактора на относительную обильность доминирующих бактерий на соответствующем таксономическом уровне (средняя относительная обильность >1%). После исключения неклассифицированных семейств была создана тепловая карта (на основе евклидова расстояния как меры несходства) для отображения вариаций в относительной обильности доминантных бактериальных семейств, чья относительная обильность показала значительные изменения под воздействием экспериментальных факторов (на основе результатов ANOVA). Наконец, ранговый коэффициент корреляции Спирмена (p < 0,05, скорректированный по Бенджамини-Хохбергу) использовался для анализа корреляции между характеристиками роста проростков пшеницы и питательными веществами и бактериальными семействами в почвенных микробных экстрактах.

Водорастворимые питательные вещества в почвенных суспензиях

Почвенные экстракты из условий современного климата содержали более высокое количество TNb по сравнению с условиями будущего климата при обоих типах земледелия (Рисунок 1B). Почвенная суспензия из традиционного земледелия в условиях современного климата имела самую высокую концентрацию TP (значимое взаимодействие земледелие × климат; Рисунок 1B). Кроме того, K показал более высокую концентрацию в условиях будущего климата, независимо от систем земледелия (Рисунок 1B).

Параметры роста проростков

История климата микробных экстрактов была основным источником вариаций, объясняющих прорастание семян пшеницы (F = 63,16; Дополнительная таблица S1), при этом семена, инокулированные микроорганизмами, подвергавшимися современному климату, в целом показали самую высокую скорость прорастания (6-й день на Рисунке 2A). Кроме того, семена, инокулированные почвенными микроорганизмами, извлеченными из традиционного земледелия с историей современного климата, показали самую высокую и быструю скорость прорастания по сравнению с другими обработками (Рисунок 2A). Напротив, микроорганизмы, полученные из органического земледелия и подвергавшиеся будущему климату, показали самую низкую и более медленную скорость прорастания во всех комбинациях обработок (Рисунок 2A; Дополнительная таблица S1). Что касается биомассы проростков, мы наблюдали, что семена, инокулированные почвенным микробным экстрактом из органического земледелия в условиях будущего климата, дали самую высокую биомассу (в среднем 0,192 г/растение; Рисунок 2B). С другой стороны, неинокулированные семена и семена, инокулированные почвенным экстрактом из традиционного земледелия в условиях современного климата, дали самую низкую биомассу (в среднем 0,162 и 0,160 г/растение соответственно; Рисунок 2B).

Рисунок 2 (A) Скорость прорастания и время прорастания и (B) надземная биомасса каждого проростка, где семена были инокулированы почвенными микробными экстрактами из разных историй земледелия (органическое vs. традиционное) и климата (будущий vs. современный) и неинокулированные контрольные растения. Буквы обозначают значимые различия на основе апостериорного теста Тьюки.

Разнообразие и структура бактериальных сообществ в почвенных экстрактах и проростках

Не было обнаружено значимых независимых или интерактивных эффектов историй земледелия и климата на бактериальное разнообразие в почвенных экстрактах (Рисунок 3A и Таблица 1). Однако семена, инокулированные почвенными микробными экстрактами из органического земледелия, показали более высокое бактериальное разнообразие, ассоциированное с проростками, по сравнению с другими обработками (Рисунок 3B и Таблица 1). Более того, влияние климатической истории почвенных микроорганизмов было заметно только в органическом земледелии, где проростки, подвергавшиеся воздействию почвенных микроорганизмов с историей будущего климата, демонстрировали более высокий уровень бактериального разнообразия (значимый интерактивный эффект земледелия и климата; Рисунок 3B и Таблица 1).

Рисунок 3 Бактериальное разнообразие Шеннона (A) почвенных микробных экстрактов и (B) проростков пшеницы. (C) Анализ главных координат (PCoA) несходства Брея–Кертиса, визуализирующий влияние типа образца, истории земледелия и климата на состав бактериальных сообществ, ассоциированных с почвенными экстрактами и проростками пшеницы.

Таблица 1 Дисперсионный анализ (ANOVA) для оценки влияния историй земледелия и климата и их взаимодействий на бактериальное разнообразие Шеннона и бактериальные сообщества почвенных экстрактов и проростков.

Земледелие (Farming) относится к истории почвенных микроорганизмов, извлеченных из органического и традиционного сельского хозяйства, а климат (Climate) относится к истории почвенных микроорганизмов, извлеченных из условий будущего и современного климата при каждом типе земледелия.

Мы провели анализ главных координат (PCoA), чтобы увидеть, как на структуру бактериального сообщества повлияли экспериментальные факторы с учетом как почвенных микробных экстрактов, так и проростков пшеницы. Эти результаты выявили заметные различия в бактериальных сообществах между типами образцов, где почвенные экстракты и проростки сгруппировались отдельно вдоль первой оси графиков PCoA (Рисунок 3C). Бактериальные сообщества проростков разделялись по экспериментальным факторам вдоль второй оси графиков PCoA (Рисунок 3C). Из-за сильного влияния типа образца на бактериальные сообщества мы провели анализ Permanova для образцов почвенных экстрактов и проростков отдельно, чтобы подтвердить закономерности PCoA (Таблица 1). Результаты анализа Permanova показали, что история климата оказывала значимое прямое влияние на структуру бактериального сообщества почвенных микробных экстрактов (Таблица 1). Что касается проростков, истории земледелия и климата почвенных микроорганизмов имели значимые прямые и интерактивные эффекты на перестройку бактериального сообщества проростков. Было обнаружено, что история климата является основным источником вариаций (более высокое значение F в Таблице 1) с четким градиентом от современного к будущему климату и к неинокулированным контрольным растениям вдоль второй оси графиков PCoA, что было более выражено при органическом земледелии (Рисунок 3C).

Сходство и общие ASV между почвенными экстрактами и проростками

Мы дополнительно проверили, существует ли большее сходство между почвенными микробными экстрактами и инокулированными проростками по сравнению с неинокулированными контрольными растениями. Несходство Брея–Кертиса было рассчитано для каждого почвенного экстракта и соответствующих инокулированных растений, а также для почвенного экстракта и контрольных растений. Результаты показали, что для органического земледелия проростки, инокулированные микроорганизмами из почвы с предшествующим опытом будущего климата, были более сходны друг с другом, чем контрольные растения (незначимое p-значение для PC2; Дополнительная таблица S2). Также было больше общих ASV между почвенным экстрактом и проростками из будущего климата (16 ASV; Дополнительный рисунок S2A), чем для современного климата. Однако для растений, подвергнутых воздействию микроорганизмов из традиционного земледелия, проростки показали большее сходство (Дополнительная таблица S2) и общие ASV (23 ASV; Дополнительный рисунок S2B) с соответствующим почвенным экстрактом только для современного климата.

Состав бактериальных сообществ

Мы исследовали изменения в составе бактериальных сообществ на уровнях типов/классов (топ-10; Дополнительный рисунок S3) и порядков (топ-25; Дополнительные рисунки S4,S5) для почвенных экстрактов и инокулированных и неинокулированных образцов растений. На уровне порядков в случае почвенных экстрактов относительная обильность бактерий, связанных с IMCC26256 (принадлежащих к типу Acidobacteriota) и Xanthomonadales при традиционном земледелии, была значительно выше, чем при органическом (прямой эффект земледелия; Таблица 2 и Дополнительный рисунок S4). Относительная обильность Haliangiales в условиях современного климата была значительно выше, чем в условиях будущего климата, независимо от истории земледелия (прямой эффект климата; Таблица 2 и Дополнительный рисунок S4). Что касается обработанных растений, относительные обильности Cytophagales и Sphingobacteriales были выше в условиях будущего климата, чем современного, только для органического земледелия (Таблица 2 и Дополнительный рисунок S5). Относительные обильности Burkholderiales и Xanthomonadales были выше в условиях будущего климата независимо от типа земледелия (Таблица 2 и Дополнительный рисунок S5).

Таблица 2 Дисперсионный анализ (ANOVA) для значимых эффектов историй земледелия и климата и их взаимодействий на бактерии на уровнях порядка и семейства для почвенных экстрактов и проростков (показаны только значимые значения).

Для рассмотрения более детальных таксономических уровней была использована тепловая карта для визуализации вариаций в относительной обильности доминантных членов бактериальных сообществ на уровне семейств (топ-70; Таблица 2 и Рисунок 4), которые показали значимые различия по экспериментальным факторам. Что касается почвенных микробных экстрактов, относительные обильности доминантных бактериальных семейств значительно варьировали в зависимости от историй земледелия и климата (Рисунок 4A и Таблица 2). Эффект земледелия был значимым для BIrii41 (принадлежащих к типу Myxococcota), Chthoniobacteraceae, Nannocystaceae, Xanthomonadaceae (Рисунок 4A и Таблица 2). Эффект климата был значимым для Bdellovibrionaceae, Caulobacteraceae, Comamonadaceae, Haliangiaceae, Micrococcaceae, Opitutaceae и Rhodanobacteraceae (Рисунок 4A и Таблица 2). Взаимодействие между земледелием и климатом было значимым для нескольких семейств, таких как Longimicrobiaceae, Micropepsaceae, Rhizobiaceae, Rhizobiales Incertae Sedis, Sutterellaceae, Verrucomicrobiaceae (Рисунок 4A и Таблица 2). Например, относительная обильность Rhizobiales Incertae Sedis была обогащена в условиях будущего климата, что было заметно только для органического земледелия. Противоположная закономерность наблюдалась для Micropepsaceae и Rhizobiaceae, где почвенные экстракты из традиционного земледелия в условиях современного климата показали более высокую обильность, чем другие обработки.

Рисунок 4 Тепловые карты, показывающие распределение обильности доминантных бактериальных семейств [в почвенном экстракте (A) и в обработанном растении (B)], относительная обильность которых была значимо подвержена влиянию экспериментальных факторов. Показаны тип (филум) и порядок, к которым принадлежит каждое семейство. Тепловые карты окрашены на основе z-оценок по строкам со стандартными методами кластеризации (евклидовы расстояния).

Что касается обработанных растений, обильность Bacillaceae и Micrococcaceae была значительно выше в условиях современного климата только для традиционного земледелия. С другой стороны, обильность Yersiniaceae, Beijerinckiaceae и Spirosomaceae была значительно выше в условиях будущего климата только для органического земледелия (значимое взаимодействие земледелие × климат; Рисунок 4B; Таблица 2). Относительная обильность Sphingobacteriales была выше в условиях будущего климата при обеих историях земледелия с более выраженной закономерностью для органического земледелия (Рисунок 4B и Таблица 2).

Корреляция между параметрами роста проростков и бактериями и питательными веществами в почвенных экстрактах

Мы провели корреляционный анализ Спирмена для изучения возможных связей между параметрами роста проростков и бактериальными семействами и питательными веществами в почвенных экстрактах (Дополнительная таблица S4). Для бактерий корреляция проводилась только для тех семейств, чья обильность была значимо подвержена влиянию экспериментальных факторов. Поскольку наиболее интересные различия в скорости прорастания и биомассе наблюдались между органическим земледелием в условиях будущего и традиционным земледелием в условиях современного климата, здесь результаты корреляции сосредоточены на этих двух обработках. В контексте традиционного земледелия мы наблюдали положительную корреляцию между скоростью прорастания и обильностью Micropepsaceae (коэффициент Спирмена = 0,84) и Rhizobiaceae (коэффициент Спирмена = 0,462). Анализируя данные по относительной обильности (Рисунок 4A) и скорость прорастания (Рисунок 2A), мы видим, что такая положительная корреляция может быть объяснена историей климата: более высокая относительная обильность этих двух семейств в почвенном экстракте из современного климата положительно коррелировала с более высокой скоростью прорастания в этой обработке. Для органического земледелия более высокая относительная обильность Rhizobiales Incertae Sedis в почвенном экстракте из будущего климата положительно коррелировала с более высокой биомассой проростков (коэффициент Спирмена = 0,459). При обеих историях земледелия более высокие концентрации TNb в условиях современного климата показали положительную корреляцию со скоростью прорастания семян (органическое: коэффициент Спирмена = 0,720; традиционное: коэффициент Спирмена = 0,459). Эта тенденция наблюдалась для TP, но только в традиционном земледелии (коэффициент Спирмена = 0,384). Более высокие уровни K в органическом земледелии в условиях будущего климата положительно коррелировали с биомассой проростков (коэффициент Спирмена = 0,161).

В этом исследовании мы воспользовались преимуществами крупного многолетнего полевого эксперимента, в ходе которого собрали почву с органических и традиционных полей с различными климатическими условиями для экстракции микроорганизмов и инокуляции семян пшеницы. Основной целью было изучение того, влияют ли водорастворимые почвенные микробиомы из разных сельскохозяйственных практик и климатических условий на скорость и время прорастания, а также на надземную биомассу проростков пшеницы и их ассоциированные бактериальные сообщества. На основе агаровых сред мы показали, что семена, инокулированные микробными экстрактами из традиционного земледелия в условиях современного климата, демонстрировали самую высокую и быструю скорость прорастания. Напротив, семена, подвергнутые воздействию микроорганизмов из органического земледелия в условиях будущего климата, показали самую низкую и более медленную скорость прорастания, но привели к более высокой надземной биомассе и бактериальному разнообразию, ассоциированному с проростками. Эти результаты свидетельствуют о том, что в сценариях будущего климата органическое сельское хозяйство может способствовать более устойчивым взаимодействиям растений и микроорганизмов, что подтверждается более высоким бактериальным разнообразием и надземной биомассой проростков пшеницы.

Почва, собранная с экспериментальных полевых участков в условиях будущего климата, претерпела больше изменений в осадках и повышенной температуре (в среднем на 0,55°C среднесуточной температуры и на 1,1°C минимальных температур) по сравнению с участками современного климата (Schädler et al., 2019). Такое повышение температуры привело к удлинению безморозного периода на участках со стрессовым воздействием (Schädler et al., 2019). Таким образом, комбинация этих стрессовых факторов, повторявшаяся в течение 10 лет, может влиять на почвенное микробное сообщество и его структуру, а также на абиотические характеристики почвы, и эти эффекты могут усиливаться или смягчаться в зависимости от типа агрономического управления. В нашем исследовании определенные важные порядки и семейства бактерий в почвенных микробных экстрактах показали различные закономерности обильности в связи с историями земледелия и климата. В частности, почвенный экстракт из традиционного земледелия в условиях современного климата показал увеличение обильности Micropepsaceae и Rhizobiaceae. Сообщалось, что представители Rhizobiaceae продуцируют гиббереллины (известные как усилители прорастания семян) в качестве важного фитогормона (Gopalakrishnan et al., 2015), что потенциально может способствовать прорастанию семян. С другой стороны, почвенные экстракты из органических хозяйств в условиях будущего климата содержали более высокую обильность группы Rhizobiales Incertae Sedis, которая известна своей способностью к азотфиксации (Garrido-Oter et al., 2018), вероятно, способствуя увеличению биомассы проростков. Наши результаты согласуются с более ранним сообщением Quattrone et al. (2024) о том, что более высокая обильность семейств Rhizobiales Incertae Sedis в ризосферных почвах положительно влияла на биомассу проростков кукурузы (Quattrone et al., 2024).

Кроме того, мы показали, что почвенные микробные экстракты, использованные в качестве источника инокулюма, значительно изменяли бактериальные сообщества, ассоциированные с проростками. Это открытие сходно с предыдущими исследованиями, показывающими, что почвенные микроорганизмы играют важную роль в колонизации микробиомов, ассоциированных с растениями (Hardoim et al., 2012; Grady et al., 2019; Azarbad et al., 2020; Walsh et al., 2021; Azarbad, 2022). Например, Walsh et al. (2021) показали, что почвенные микробные экстракты (где почвы были собраны из 219 различных типов почв по всей территории США) оказывали значительное влияние на формирование микробиомов проростков пшеницы через неделю роста после инокуляции семян. Здесь мы показали, что относительная обильность нескольких бактериальных семейств (например, Yersiniaceae, Beijerinckiaceae, Spirosomaceae и Sphingobacteriales) была заметно выше у проростков, инокулированных почвенными микробными экстрактами из органического земледелия в условиях будущего климата. В рамках разработки синтетических микробных сообществ для повышения урожайности сельскохозяйственных культур Gonçalves et al. (2023) продемонстрировали, что виды Beijerinckiaceae содержат комплексный набор генов, ответственных за транспорт, гомеостаз и деградацию фосфатов, а также продукцию сидерофоров и синтез индол-3-уксусной кислоты (IAA). Такие полезные бактерии из инокулюма могут потенциально улучшать здоровье исходных семенных микробиомов (и, следовательно, проростков), замещая не- или менее полезные виды бактерий, уже присутствующие внутри и снаружи семян, или действуя синергетически с другими полезными бактериями для колонизации проростков. Если это так, такие взаимодействия между бактериями исходного микробиома и бактериями, введенными с инокулюмом, могут усиливать общее функционирование сообщества, приводя к благоприятным эффектам для растений-хозяев (Afkhami, 2023; Allsup et al., 2023). Действительно, семена, инокулированные микроорганизмами, подвергавшимися сценариям будущего климата в рамках органического земледелия, демонстрировали более высокое бактериальное разнообразие, ассоциированное с проростками, положительно связанное с увеличением биомассы проростков. Наши результаты согласуются с предыдущим исследованием, проведенным на поле GCEF, которое показало, что органическая практика земледелия в условиях будущего климата значительно увеличивала общее богатство AMF, колонизирующих корни пшеницы (Wahdan et al., 2021). Такие результаты поддерживают идею о том, что органические методы ведения сельского хозяйства не только смягчают неблагоприятные последствия изменения климата, но и способствуют разнообразию бактерий, ассоциированных с проростками.

Важно подчеркнуть, что комбинированный эффект климата и агрономического управления может влиять не только на почвенные биотические факторы, но и на абиотические свойства. Поэтому, помимо микробных эффектов, водорастворимые питательные вещества из почвы, даже в разбавленном виде, также могут влиять на параметры роста проростков. Мы наблюдали, что более высокая скорость прорастания семян, инокулированных микроорганизмами из традиционного земледелия в условиях современного климата, положительно коррелировала с уровнями общего азота и фосфора, но это не отражалось на преимуществе в росте проростков. Некоторые исследования показали, что сухие среды (такие как условия будущего климата) приводят к более высоким уровням K в почве, чем влажные, что связано с тем, что K быстрее вымывается из опада, чем другие питательные вещества (например, N и P), и, таким образом, имеет значительно меньшее время пребывания в почвенном органическом веществе (Sardans and Peñuelas, 2021). Это может объяснить более высокий уровень K, который мы наблюдали в условиях будущего климата и который показал положительную корреляцию с более высокой биомассой проростков в органическом земледелии. Эти результаты показывают сложное взаимодействие между агрономическим управлением и климатическими сценариями с противоположными эффектами на почвенные биотические и абиотические факторы. Поэтому в данном исследовании невозможно сделать вывод о том, обусловлены ли наблюдаемые закономерности в параметрах роста проростков микроорганизмами или уровнями питательных веществ в почвенных экстрактах. Однако, поскольку более высокие уровни N и P не прогнозировались в более высоком росте проростков, это придает больший вес идее о том, что благотворное влияние почвенных микроорганизмов на рост растений может быть более критичным, по крайней мере частично, чем некоторых питательных веществ. Имея список культивируемых бактериальных видов из почвенных экстрактов (показан на Дополнительном рисунке S1), следующим шагом является создание синтетических бактериальных сообществ для разделения эффекта микроорганизмов от абиотических факторов на параметры роста проростков. Это поможет подтвердить наши результаты, основанные на подходе инокуляции "всего сообщества".

Важно отметить, что существует несколько ограничений, которые следует учитывать при интерпретации результатов нашего исследования. Условия, определяемые в GCEF для органического и традиционного земледелия, основаны на европейских нормативных актах (в частности, в Германии), таким образом, ограничены конкретными регионами и не обязательно экстраполируются на другие среды или страны. Тип эксперимента, разработанный для оценки влияния микроорганизмов на инокулированные растения пшеницы, не является репрезентативным для реальных полевых условий. Только часть почвенных бактерий (а не грибов) сможет расти и выживать в стерильных агаровых контейнерах, и, таким образом, только культивируемые бактерии могут влиять на параметры роста проростков. Будущие исследования в условиях почвенных мезокосмов или полевых условиях помогут подтвердить наши выводы с учетом большего количества генотипов пшеницы и мониторинга различных морфологических и физиологических признаков растений (включая количество и качество семян при сборе урожая), а также микробных параметров (включая как бактерии, так и грибы) в течение вегетационного периода.

Наши результаты подчеркивают важность практики органического земледелия в содействии бактериальному разнообразию и потенциальном повышении биомассы проростков. Следующим шагом является ответ на открытые вопросы о деталях функционирования почвенного и растительного микробиома, которые связаны с преимуществами для растений при различных историях агрономических практик и климата. Эти знания могут поддержать сельскохозяйственные стратегии для устойчивых и жизнеспособных систем производства продовольствия, особенно перед лицом климатической неопределенности.

Дополнительные материалы к этой статье можно найти онлайн по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2024.1355158/full#supplementary-material

Ornik M, Salinas R, Antonacci G, Schädler M and Azarbad H (2024) The stress history of soil bacteria under organic farming enhances the growth of wheat seedlings. Front. Microbiol. 15:1355158. doi: 10.3389/fmicb.2024.1355158

Перевод статьи «The stress history of soil bacteria under organic farming enhances the growth of wheat seedlings» авторов Ornik M, Salinas R, Antonacci G, Schädler M and Azarbad H., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык

Фото: Designed by Freepik