Засуха и бактерии: органическое земледелие проигрывает традиционному в отборе полезных микробов

Устойчивость к недостатку влаги имеет решающее значение для приспособленности и выживания растений, особенно при повторяющихся засухах. Однако некоторые почвенные микроорганизмы способны повышать толерантность растений к стрессам, например, те, которые обладают активностью 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК)-деаминазы.

Микроорганизмы, адаптированные к засушливым условиям, могут со временем накапливаться в ризосфере благодаря таким свойствам, как спорообразование, предпочтение определённых субстратов или толщина клеточной стенки. Однако сложность и взаимосвязь абиотических факторов (например, засухи или типа обработки почвы) и биотических факторов (например, видовой принадлежности растений) затрудняют понимание общих закономерностей селекции таких микроорганизмов.

В ходе горшечного эксперимента, в котором пшеница и ячмень выращивались на почвах традиционного и органического земледелия, мы оценили, как предшествующие засушливые условия влияют на почвенные микроорганизмы, сравнивая однократное и многократное ограничение полива. Анализ показал, что недостаток влаги сильно изменяет состав как всего микробного сообщества (гены 16S рРНК), так и сообщества микроорганизмов, положительных по АЦК-деаминазе (acdS+), в ризосфере. При этом повторяющиеся засухи оказывают менее выраженное влияние на численность и разнообразие обоих сообществ по сравнению с однократной засухой.

Мы выявили совместное действие типа почвы (традиционное или органическое земледелие) и режима предварительной закалки недостатком влаги. Возможно, благодаря лучшему питательному статусу, растения, выращенные на почвах традиционного земледелия, показали более высокий рост и способствовали отбору более адаптированных микробных таксонов. Некоторые из них уже известны своими полезными для растений свойствами (например, Actinobacteria Streptomyces), но, что интересно, некоторые Proteobacteria также оказались обогащёнными после предшествующих засух в условиях традиционного земледелия. Наш подход позволил идентифицировать ключевые микробные таксоны, способствующие адаптации злаков к засухе, что улучшает наше понимание влияния засушливых условий на взаимодействия растений и микроорганизмов.

Растения взаимодействуют с большим разнообразием микроорганизмов в почвах, особенно в ризосфере — зоне, находящейся под непосредственным влиянием корней. Микробные сообщества различаются у разных видов растений или генотипов и могут оказывать различное воздействие на здоровье растений (Raaijmakers et al., 2009; Berendsen et al., 2012). Для противодействия различным стрессовым факторам растения привлекают полезные микроорганизмы в свою ризосферу (Naylor and Coleman-Derr, 2018), которые объединяют под названием ризобактерии, стимулирующие рост растений (PGPR). Спектр действия этих PGPR включает ряд функциональных признаков, таких как биоудобрение, стимуляция роста корней, подавление патогенов, ризоремедиация и индукция системной устойчивости. Эти процессы часто являются результатом изменений уровней продукции растительных гормонов (Lugtenberg and Kamilova, 2009; Vacheron et al., 2013; Backer et al., 2018). Этилен — фитогормон, играющий центральную роль в развитии растений и их ответах на стрессовые условия, особенно на уровне корней (Tanimoto et al., 1995; Mattoo and Suttle, 2017). Поскольку биосинтез этилена усиливается в ответ на биотические и абиотические стрессы окружающей среды, продукция этилена может служить индикатором чувствительности растений к различным стрессорам (Morgan and Drew, 1997; Balota et al., 2004). Снижая концентрацию этилена в стрессированных растениях, фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК)-деаминаза, кодируемый геном acdS у некоторых PGPR, расщепляет предшественник этилена АЦК до аммиака и α-кетобутирата (Glick, 2005, 2014). Это снижение стресса растений, основанное на микробной АЦК-деаминазе, уже было продемонстрировано для различных экологических стрессоров, таких как затопление, засуха, жара, холод, колонизация патогенами, а также высокие концентрации солей, тяжелых металлов и органических загрязнителей (Gamalero and Glick, 2012).

В связи с современными глобальными изменениями прогнозируется увеличение частоты и интенсивности засушливых явлений (Spinoni et al., 2018; Hari et al., 2020), что окажет значительное влияние на продуктивность растений, а также на биогеохимически значимые почвенные процессы (Fahad et al., 2017; Canarini et al., 2021). Растения продуцируют повышенные количества этилена при воздействии засухи, и при этом чувствительные к стрессу растения образуют больше этилена, чем устойчивые (Balota et al., 2004). Стресс-ослабляющее действие штаммов PGPR, содержащих АЦК-деаминазу (acdS+), основано на отрицательном влиянии на продукцию этилена, которая подавляет рост растений, а также на поддержке антиоксидантных систем растения (Jaemsaeng et al., 2018; Gowtham et al., 2020; Murali et al., 2021). На функциональном уровне существует обширная литература о положительном эффекте инокуляции штаммов PGPR с acdS+ для повышения засухоустойчивости и смягчения последствий засухи у растений (например, Arshad et al., 2008; Shakir et al., 2012; Danish et al., 2020). Однако эти исследования проведены с ограниченным набором бактерий, тогда как в природе растения постоянно взаимодействуют с множеством микроорганизмов, обладающих разными функциональными свойствами. Партнеры — растения и микроорганизмы, участвующие в этих взаимодействиях, образуют голобионт, который рассматривается как единица отбора в эволюции (Zilber-Rosenberg and Rosenberg, 2008), движущая процессами акклимации и/или адаптации, особенно в условиях стрессового давления.

В условиях засухи растения демонстрируют измененное распределение углерода и состав корневых экссудатов (Sanaullah et al., 2012; Gargallo-Garriga et al., 2018), что приводит к перестройке микробных сообществ ризосферы (Berg and Smalla, 2009; Santos-Medellín et al., 2017; Zhalnina et al., 2018; Canarini et al., 2021). Представители этих перестроенных ассоциированных с растениями микробных сообществ могут способствовать выживанию растений, поддерживая краткосрочную акклимацию за счет продукции фитогормонов или экзополисахаридов (прямой ответ) и долгосрочную адаптацию (после нескольких циклов роста растений) к засушливому стрессу через отбор адаптированного микробного сообщества (Lau and Lennon, 2012; Marasco et al., 2012; Vurukonda et al., 2016). История засухи, т. е. последствия повторяющихся засушливых событий, может влиять на почвенные процессы или продуктивность растений через воздействие на почвенное микробное сообщество (Canarini et al., 2021; Munoz-Ucros et al., 2022). Влияние истории засухи анализировалось с точки зрения устойчивости (способность сообщества противостоять нарушению) и резильентности (способность сообщества восстанавливаться после нарушения после повторного увлажнения; Griffiths and Philippot, 2013) после коротких периодов засухи (de Nijs et al., 2019; Veach and Zeglin, 2020; Leizeaga et al., 2021). Процессы устойчивости и резильентности касаются быстрых реакций во время стресса или непосредственно после него. В отличие от этого, долгосрочная адаптация к стрессу подразумевает отбор адаптированных микробных сообществ, несущих полезные функции, после повторяющихся стрессовых событий для лучшего перенесения последующих стрессов (Evans et al., 2014; Bastida et al., 2017). В этом контексте роль отбора адаптированных PGPR для поддержки растений в условиях стресса неясна.

Обратная связь «растение–почва» описывает относительный рост растения в собственной почве того же вида по сравнению с его ростом в почве другого вида, которая была скондиционирована другим видом растения (Bever et al., 1997). Обратная связь «растение–почва» (PSF) происходит, когда растения изменяют свойства почвы, такие как доступность питательных веществ или спектр вторичных метаболитов, а также модифицируют ассоциированные с растениями микробные сообщества (Bennett and Klironomos, 2019). Традиционно PSF изучали в тепличных экспериментах без учета абиотических или биотических драйверов, хотя в последнее время стало очевидно, что изменения окружающей среды могут влиять как на силу, так и на направление PSF (De Long et al., 2019). Например, предшествующая засуха может не только модифицировать PSF, влияя на реакции роста растений того же и другого видов и опосредуя эффекты наследия засухи на микробные сообщества, но и влиять на ответы растений и микроорганизмов на последующую засуху (Kaisermann et al., 2017). Влияя на численность и состав полезных для растений микроорганизмов, например, популяции acdS+, обратная связь «растение–почва» и история засухи могут влиять на рост растений. Таким образом, прямая связь между влиянием истории водного дефицита на полезные для растений микробные сообщества acdS+ и повышением засухоустойчивости растений еще требует подтверждения (de Vries et al., 2020).

Недавно Буффо с соавт. (Bouffaud et al., 2018) разработали подход для количественного определения и характеристики этих PGPR, использующий специфические ПЦР-праймеры для выявления микроорганизмов, продуцирующих АЦК-деаминазу. Ген acdS высококонсервативен среди микроорганизмов (бактерий и микроэукариот) и, таким образом, является подходящим маркером для оценки функциональных сообществ АЦК-деаминазы и их динамики в условиях засухи. Исследования, основанные на этом подходе, показали, что численность и разнообразие микроорганизмов acdS+ модулируются видом растения и генотипом растения (Bouffaud et al., 2018), полевыми условиями, а для кукурузы — стадией развития растения (Renoud et al., 2020), а также глубиной почвы (Gebauer et al., 2021). До сих пор отсутствовал анализ влияния водного дефицита на сообщества acdS+ в разных системах земледелия. Альфа-разнообразие микробных сообществ в системах органического земледелия часто описывается как более высокое по сравнению с системами традиционного земледелия (Hartmann et al., 2015; Lupatini et al., 2017; Harkes et al., 2019), что повышает потенциал сообщества PGPR поддерживать рост растений в этой системе землепользования (Hole et al., 2005; Jangid et al., 2008; Gomiero et al., 2011). Обогащение ризосферы микроорганизмами acdS+ представляет собой эффективное средство стимуляции роста растений при абиотическом стрессе (Glick, 2014). Таким образом, исследование того, как история водного дефицита влияет на численность и состав сообщества генов acdS+, и как это связано с агроуправлением, может дать важные представления о потенциале почвенных бактерий acdS+ для поддержания продуктивности сельскохозяйственных культур в условиях глобальных изменений.

Принимая во внимание более ранние исследования по генным маркерам acdS и поскольку эксперименты по истории засухи показали, что эффекты наследия взаимодействуют с абиотическими и биотическими драйверами (Kaisermann et al., 2017; Bennett and Klironomos, 2019; Canarini et al., 2021), мы исследовали, как присутствие злаков, вид злака и система земледелия модулируют эффект наследия водного дефицита на микробное сообщество acdS+. С этой целью мы заложили горшечный эксперимент, используя черноземную почву, отобранную на участках традиционного и органического земледелия экспериментальной платформы Global Change Experimental Facility (GCEF; Schädler et al., 2019) (Рисунок 1). В качестве модельных систем были выбраны пшеница (Triticum aestivum L.) как наиболее распространенная, и диплоидный ячмень (Hordeum vulgare L.) как пятая по распространенности зерновая культура в мире (www.fao.org/faostat). Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы изучить влияние истории почвенного водного дефицита, т. е. предшествовавшего дефицита воды, на состав микробного сообщества пшеницы и ячменя, выращиваемых в условиях водного дефицита на второй год. Для этого мы проанализировали как (i) общее сообщество прокариот с использованием секвенирования ампликонов гена 16S рРНК (Illumina MiSeq), так и (ii) численность и состав сообщества функциональной группы микроорганизмов acdS+ (кПЦР и Illumina MiSeq).

Рисунок 1  Схема эксперимента. В течение фазы кондиционирования (октябрь 2016 – июль 2017) горшки заполняли почвой с экспериментальной установки Global Change Experimental Facility (GCEF), управляемой в режиме традиционного или органического земледелия. Примерно две трети горшков были засеяны озимой пшеницей, одна треть оставалась без растений. Половину горшков хорошо поливали (60% максимальной влагоемкости почвы; WHC), а другую половину подвергали условиям водного дефицита (25% WHC), при этом вносили соответствующие удобрения для OF и CF (Breitkreuz et al., 2021). Растения удалили в июле 2017 г., и почва оставалась в соответствующих горшках до апреля 2018 г. при 4°C. Фаза применения началась с апреля по июль 2018 г., при этом ко всем горшкам применяли водный дефицит (25% WHC), и дальнейшего внесения удобрений не проводили. Горшки, засеянные озимой пшеницей в фазу кондиционирования, использовали для выращивания яровой пшеницы или ярового ячменя, а незасеянные горшки оставались с голой почвой (n = 5 горшков). CD: «однократный водный дефицит» — контрольные и засушливые условия; DD: «история водного дефицита» — засушливые условия и засушливые условия.

Эта работа была основана на трех гипотезах. Во-первых, мы предположили, что присутствие растений стимулирует отбор микробных сообществ и дополнительно определяется историей водного дефицита. Мы ожидали положительной PSF в почве того же вида (пшеница в первый и второй год эксперимента), предполагая, что с тем же растением микробное сообщество уже отобрано к засушливым условиям, и ниши в ризосфере, существовавшие в первый период водного дефицита, будут сохраняться и во второй период. Вторая гипотеза была выдвинута исходя из того, что бактериальное разнообразие, как ожидается, будет выше в условиях органического земледелия, которое представляет ограниченные ресурсы, но предоставляет больше ниш (Thakur et al., 2020) и более широкий функциональный пул почвенных микроорганизмов для борьбы с засушливым стрессом. Она гласила, что история водного дефицита модифицирует формирование микробного сообщества, и этот эффект сильнее при органическом земледелии. Наконец, третья гипотеза была выдвинута на основе сообщений об отборе полезных для растений сообществ ризосферой (Mendes et al., 2014; Yuan et al., 2018). Мы предположили, что взаимодействие между историей водного дефицита и системами земледелия особенно влияет на состав сообщества acdS+ в ризосфере и отбирает таксоны, адаптированные к засушливым условиям.

Сбор почвы и схема эксперимента

Горшечный эксперимент проводили в течение двух полных вегетационных периодов: фазы кондиционирования в первый год и фазы применения во второй год (Рисунок 1). Схема эксперимента фазы кондиционирования опубликована в работе Breitkreuz et al. (2021). Кратко: почву отбирали из верхних 15 см участков органического (OF) и традиционного (CF) земледелия экспериментальной установки Global Change Experimental Facility (GCEF, Schädler et al., 2019) на полевой исследовательской станции UFZ в Бад-Лаухштедте, Центральная Германия [51°2393599N 11°5295599E, 118 м над уровнем моря, среднегодовая температура: 9,7°C (1993–2013)]. Тип почвы на исследовательской станции — плодородный суглинистый чернозем (Haplic Chernozem) (Altermann et al., 2005). Системы органического и традиционного земледелия были внедрены осенью 2013 года. Традиционное управление включает севооборот рапс–пшеница–ячмень и внесение минеральных NPK-удобрений, пестицидов и регуляторов роста растений. Напротив, органическое управление осуществляется в соответствии с регламентом ЕС по органическому сельскому хозяйству (European Union, 2007), т. е. без применения средств защиты растений или продуктов роста. Кроме того, минеральное азотное удобрение заменяется включением бобовых в севооборот (бобовые–пшеница–ячмень). Помимо биологической фиксации азота бобовыми, удобрения при органическом управлении вносятся исключительно в виде фосфоритной муки и патенткали (K-Mg-S). Предварительно адаптированные почвы гомогенизировали и просеивали (10 мм). Для горшечного эксперимента 9,3 кг чернозема взвешивали в мешки, смешивали с удобрениями и водой (60% от максимальной влагоемкости почвы; WHC) и заполняли в 7-литровые горшки Kick–Brauckmann (STOMA GmbH, Зигбург, Германия). Вносимые удобрения подбирали в соответствии с рекомендациями для традиционного и органического земледелия. Источниками фосфора (P), калия (K) и азота (N) для традиционного земледелия служили суперфосфат, 60% K2O и аммиачная селитра, а для органического — гранулированный сырой фосфат (Physalg 25), калийная соль (патенткали) и мочевина соответственно. Горшки как традиционного, так и органического земледелия были равномерно удобрены 2 г N, 1 г P и 2 г K. Дополнительное внесение 0,5 г Mg (MgSO4), 0,15 г FeCl3 и смеси микроэлементов (раствор A–Z по Хогланду и Снайдеру, 1933) было исключительно для горшков традиционного земледелия.

Сначала горшки подвергали фазе кондиционирования, включающей четырехфакторный дизайн (Breitkreuz et al., 2021). Кратко: горшки заполняли почвой, которая происходила из полевых экспериментов в Тюрове (Albic Luvisol, песчаная почва) и Бад-Лаухштедте (чернозем, плодородная почва) и была долгосрочно адаптирована к системам традиционного или органического земледелия. Далее мы выбрали два разных генотипа озимой пшеницы с разными требованиями к месту (требовательный и нетребовательный) и сравнили их с незасеянными горшками в качестве контроля. Озимую пшеницу высевали либо семенами, обработанными фунгицидами (для традиционного земледелия), либо 16 необработанными семенами на горшок (для органического земледелия). Горшки случайным образом размещали на тележках в холодной теплице и поддерживали при 60% WHC в течение зимы 2016/17 гг. Для обеспечения прорастания семена первоначально поливали сверху до достижения растениями фазы трех листьев. В марте 2017 года растения уравняли до 12 штук на горшок и начали режим полива. Для этого половину горшков установили на 25% WHC. Итоговый дизайн: 2 типа почвы × 2 системы земледелия × 3 варианта растений × 2 режима полива × 5 повторностей каждого варианта = 120 горшков. Влажность контролировали ежедневным взвешиванием горшков и добавлением потерянной воды. Мы наблюдали, что сообщества прокариот были сопоставимы между двумя сортами пшеницы (Breitkreuz et al., 2021). После сбора урожая пшеницы и голой почвы в июле 2017 года горшки хранили при 4°C для сохранения адаптированных микробных сообществ. Мы ожидали, что микробные сообщества останутся стабильными во время хранения в холодильной камере, но мы осознаем, что для абсолютной уверенности в этом важен был бы анализ горшков до и после хранения.

В апреле 2018 года началась фаза применения. Дальнейшего внесения удобрений не проводили, чтобы сохранить адаптированные сообщества от фазы кондиционирования. Яровую пшеницу («Quintus», утверждена 18 декабря 2013 г., W. von Borries-Eckendorf GmbH & Co. KG, Германия) и яровой ячмень («Avalon», утвержден 20 декабря 2012 г., Saatzucht Josef Breun GmbH & Co. KG, Германия) высевали (по 12 растений на горшок) в предварительно адаптированные горшки из фазы кондиционирования (Рисунок 1). Оба вида растений характеризуются широкой приемлемостью мест возделывания и умеренной засухоустойчивостью. Горшки случайным образом размещали на тележках в холодной теплице. Для обеспечения прорастания семена первоначально поливали сверху до достижения фазы трех листьев. После этого все горшки подвергали засушливым условиям (25% WHC), и потерю воды ежедневно восполняли снизу. Непосредственно перед отбором проб, во время фазы цветения в июне 2018 года, определяли высоту надземных частей растений.

Для получения повторности отбирали по три растения на горшок. Определяли свежую и высушенную (при 60°C) надземную биомассу. Почву, плотно прилегающую к корням и считающуюся ризосферой, тщательно собирали щеткой, замораживали в жидком азоте и хранили при –80°C (ризосфера «пшеницы» или «ячменя»). Из каждого горшка без растений («голая почва») отбирали три образца почвы, объединяли, просеивали до 2 мм, замораживали в жидком азоте и хранили при –80°C. Всего в этом исследовании анализировали пять повторностей (каждая состояла из трех объединенных ризосферных или основных образцов почвы) для каждого варианта фазы применения. Варианты фазы применения обозначали в зависимости от режимов полива, применявшихся в первый и второй годы: CD («однократный водный дефицит» — контрольные и засушливые условия) и DD («история водного дефицита» — засушливые условия и засушливые условия).

Конструирование библиотек генов 16S рРНК и acdS и секвенирование

Для анализа состава микробного сообщества образцов ДНК экстрагировали из 400 мг почвы (n = 5 для каждого варианта) с помощью набора DNeasy PowerSoil (QIAGEN, Хильден, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Чистоту и количество ДНК измеряли на NanoDrop (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), а экстракты хранили при –20°C. Амплификацию вариабельной области V4 бактериального гена 16S рРНК проводили с использованием универсальной праймерной пары 515f и 806r (Caporaso et al., 2011), а частичный ген acdS амплифицировали с использованием праймеров acdSF5 и acdSR8 (Bouffaud et al., 2018), оба в двух повторностях. Праймеры были оснащены адаптерными последовательностями Illumina (Nextera XT Index Kit, Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США). Для высокоточной амплификации ПЦР проводили с использованием Kapa Hifi HotStart ReadyMix (KAPA-Biosystems, Уилмингтон, Массачусетс, США). ПЦР проводили в термоциклере S1000 (Bio-Rad Laboratories, Херкулес, Калифорния, США): начальная денатурация при 95°C в течение 5 мин, затем 25 циклов: 98°C — 20 с, 55°C — 15 с, 72°C — 15 с (для гена 16S рРНК) / 30 циклов: 65°C — 10 с, 72°C — 10 с (для acdS), и финальная элонгация при 72°C в течение 5 мин. Продукты ПЦР очищали с помощью магнитных шариков AMPure XP. Для присвоения последовательностей соответствующим образцам проводили индексную ПЦР с использованием набора Illumina Nextera XT Index Kit и Kapa Hifi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems, Уилмингтон, Массачусетс, США). Индексную ПЦР проводили в термоциклере S1000 (Bio-Rad Laboratories, Херкулес, Калифорния, США): 8 циклов: 95°C — 30 с, 55°C — 30 с, 72°C — 30 с. Продукты ПЦР снова очищали с помощью шариков AMPure XP и количественно определяли с помощью набора Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Для секвенирования образцы объединяли в пулы, и размер и качество пула проверяли на Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Пало-Альто, Калифорния, США). Парно-концевое секвенирование проводили на библиотеках 16S рРНК и acdS с использованием системы Illumina MiSeq. Сырые последовательности доступны в архиве Short Reads Archive под номером Bioproject PRJNA783187.

Обработка данных секвенирования

Для обоих наборов данных ампликонов сохраняли только риды с ожидаемыми праймерами амплификации, а риды без этих праймеров удаляли из дальнейшего анализа. Последовательности праймеров ампликонов гена 16S рРНК удаляли с помощью cutadapt версии 1.18. Полученные последовательности анализировали с использованием dadasnake версии .7 (Weißbecker et al., 2020; https://github.com/a-h-b/dadasnake), который зависит от пакета DADA2 (Callahan et al., 2016) в программе R с открытым исходным кодом (версия 3.6.1; R Core Team 2017). Риды ампликонов гена 16S рРНК укорачивали до минимального качества оснований 11 и общего максимального ожидаемого числа ошибок 5, с минимальной длиной 150 и 100 нт для прямого и обратного ридов соответственно. Более короткие риды ампликонов acdS укорачивали до 100 и 90 нт для прямых и обратных ридов с минимальным качеством оснований 11 и максимальным ожидаемым числом ошибок 0,7. Для обоих генов пары ридов объединяли без несовпадений, и определяли точные варианты последовательностей, которые использовали как ASV (варианты ампликонной последовательности). Химерные риды удаляли с использованием алгоритма «consensus» DADA2 (Callahan et al., 2016). Впоследствии варианты ампликонных последовательностей гена 16S рРНК таксономически классифицировали с использованием реализации «Bayesian Classifier» в mothur (Schloss et al., 2009) по базе данных SILVA (версия 132, нерегулярная при 99%; Quast et al., 2013). Последовательности acdS выравнивали по внутренней базе данных acdS, извлеченной из FunGene (Fish et al., 2013), с использованием BLASTn (версия 2.7.1) в соответствии с Bouffaud et al. (2018). ASV ампликонов гена 16S рРНК, не отнесенные к царствам Bacteria или Archaea, удаляли, а для ампликонов acdS удаляли ASV, не классифицированные таксономически с помощью BLASTn.

Количественная ПЦР в реальном времени

Гены 16S рРНК и acdS количественно определяли во всех образцах с использованием праймеров с линкерами Illumina для генов 16S рРНК и праймеров acdSF5/acdSR8 без линкеров для генов acdS (Bouffaud et al., 2018). Для ПЦР в реальном времени готовили смесь, содержащую 0,5 мкл каждого праймера в концентрации 10 мкМ и примерно 20 нг ДНК, и доводили до конечного объема 15 мкл с помощью 2x iQ SYBR Green Supermix. Амплификацию проводили в iCycler iQ5 (Bio-Rad Laboratories) по следующей программе: 45 циклов: 94°C — 15 с, 67°C — 15 с, 72°C — 15 с (для гена 16S рРНК) / 67°C — 15 с, 72°C — 15 с (для acdS). Количество генов acdS нормализовали по числу копий гена 16S рРНК согласно сравнительному методу Ливака и Шмиттгена (Livak and Schmittgen, 2001).

Статистика

Все статистические анализы и визуализацию выполняли в R (версия 3.6.1; R Core Team, 2017). Свежую и сухую массу растений сравнивали с использованием критерия Крускала–Уоллиса с последующим критерием Данна, поскольку данные не были нормально распределены. Влияние различных обработок на высоту растений, а также на относительную экспрессию генов по данным кПЦР анализировали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим критерием Тьюки HSD. Поскольку наборы данных относительной экспрессии генов были частично сильно асимметричны, в дополнение к ANOVA и критериям Тьюки проводили критерий Крускала–Уоллиса с последующими апостериорными тестами с использованием критерия наименьшей значимой разности Фишера и поправки Бенджамини–Хохберга в пакете «agricolae». Индекс Шеннона рассчитывали для каждого образца с использованием пакета «vegan», а влияние обработок на микробное разнообразие проверяли с помощью критерия Крускала–Уоллиса с последующим апостериорным тестом LSD Фишера с поправкой Бенджамини–Хохберга. Сравнение паттернов ASV проводили с помощью пермутационного многомерного дисперсионного анализа (PERMANOVA; Anderson, 2001) с использованием пакета «vegan». Влияние растения, кондиционирования и системы земледелия на доминирующие таксоны проверяли с помощью PERMANOVA. Влияние истории водного дефицита на дифференциальную численность проверяли с помощью DESeq2 для ASV, представляющих не менее 0,05% неразреженных ридов (Love et al., 2014), сравнивая систему земледелия и фактор растения независимо. Корреляции между количеством ридов генов acdS и 16S рРНК анализировали с помощью рангового корреляционного теста Спирмена.

Рост растений

Рост растений сильно зависел от системы земледелия (CF > OF, P < 0,001 как для сухой массы, так и для высоты) (Рисунок 2). При этом биомасса обоих видов злаков была ниже при органическом (OF), чем при традиционном земледелии (CF), но это различие было значимым только в варианте DD (Рисунок 2A, P < 0,001 и P = 0,003 для ячменя и пшеницы соответственно). Кроме того, высота растений была выше в CF, чем в OF для обеих культур в DD и CD (Рисунок 2B). Влияние кондиционирования водным дефицитом (DD против CD) на параметры растений ограничивалось отрицательным воздействием на высоту растений ячменя как в OF, так и в CF (P < 0,001, Рисунок 2B). Интересно, что кондиционирование водным дефицитом имело тенденцию к положительному, хотя и незначительному, влиянию на сухую массу ячменя в CF.

Рисунок 2  Показатели роста растений для каждой обработки: (A) сухая масса на растение и (B) средняя высота. Значения соответствуют средним значениям, а планки погрешностей — соответствующим стандартным ошибкам для пяти повторностей горшков. Буквы показывают статистические различия между обработками согласно критерию Крускала–Уоллиса с последующим апостериорным тестом LSD Фишера с поправкой P-значений Бенджамини–Хохберга. CD — без кондиционирования водным дефицитом; DD — с кондиционированием водным дефицитом.

Относительная численность микроорганизмов, несущих acdS (acdS+)

Чтобы выяснить, повлияли ли обработки на относительную численность микроорганизмов acdS+, уровни амплификации генов acdS нормализовали по численности генов 16S рРНК с использованием метода ΔCt (Livak and Schmittgen, 2001). При сравнении всех образцов ризосферы (без разделения по виду растения, системе земледелия или режиму полива) с образцами голой почвы мы обнаружили, что гены acdS менее обильны в голой почве, чем в ризосферной почве (P < 0,001). Точнее, это различие было значимым в CD в CF для ячменя (P = 0,03) и в OF для пшеницы (P = 0,006, Рисунок 3). При проверке влияния кондиционирования водой на относительную численность генов acdS в образцах ризосферы растений не было обнаружено значимых различий между CD и DD. Однако значительное положительное влияние кондиционирования водой на относительную численность сообщества acdS+ было обнаружено в образцах голой почвы (P = 0,02).

Рисунок 3  Относительная численность микроорганизмов с генами, кодирующими АЦК-деаминазу. Данные численности, полученные с помощью кПЦР, нормализованы по численности генов 16S рРНК и рассчитаны с использованием метода ΔCt (Livak and Schmittgen, 2001). Значения соответствуют средним значениям, а планки погрешностей — соответствующим стандартным ошибкам для пяти повторностей горшков. Буквы показывают статистические различия между всеми обработками согласно ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки HSD. CD — «однократный водный дефицит» (контрольные и засушливые условия), DD — «история водного дефицита» (засушливые условия и засушливые условия).

Влияние истории водного дефицита, землепользования и присутствия растений на состав и разнообразие бактериальных сообществ

Образцы ризосферы ячменя и пшеницы, а также голой почвы подвергали секвенированию ампликонов генов 16S рРНК и acdS. В общей сложности 2 225 931 рид 16S рРНК и 4 406 511 ридов acdS образовали соответственно 1 849 ASV и 4 945 ASV. Кривые разрежения представлены на дополнительном рисунке S1. Последовательности были разрежены до наименьшего числа ридов на образец (ген 16S рРНК — 20 058 ридов; ген acdS — 54 660 ридов). В совокупности риды гена 16S рРНК охватывали широкий филогенетический диапазон, а 10 наиболее обильных классов соответствовали Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Thermoleophilia, Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Bacteroidia, Blastocatellia, Nitrososphaeria и Verrucomicrobiae. Напротив, ампликоны acdS были в основном связаны только с двумя филумами — Actinobacteria и Proteobacteria. Большинство (79,6% разреженных ридов) были отнесены к Actinobacteria, главным образом к семействам Streptomycetaceae, Intrasporangiaceae и Nocardioidaceae. Почти пятая часть ридов acdS (19,6%) соответствовала Proteobacteria. В то время как 0,8% остались неклассифицированными бактериями, мы также собрали 0,0014%, соответствующих грибам из Ascomycota. Чтобы проверить, отражаются ли изменения в общем бактериальном сообществе между обработками также на уровне сообщества acdS, все роды из сообществ acdS и 16S рРНК сравнивали друг с другом. В общей сложности было идентифицировано 32 рода, присутствующих в обоих сообществах: 18 принадлежали к Actinobacteria и 14 к Proteobacteria. Значимые корреляции между паттернами распределения ридов генов 16S рРНК и acdS были обнаружены для пяти родов, идентифицированных среди очень обильных: Saccharothrix, Amycolatopsis, Marmoricola, Tetrasphaera и Streptomyces (дополнительный рисунок S2), а также Achromobacter (P = 0,021, rho = 0,3) и неклассифицированных Microbacteriaceae (P = 0,006, rho = –0,36).

Пермутационный дисперсионный анализ показал, что присутствие растений было основным фактором, определяющим состав как сообщества 16S рРНК (R² = 0,36, P < 0,001), так и acdS (R² = 0,22, P < 0,001) (Таблица 1). Более того, индексы разнообразия Шеннона для бактериальных (дополнительный рисунок S3a) и сообществ acdS (дополнительный рисунок S3b) в целом были выше в голой почве, чем в образцах ризосферы. Это различие было обнаружено для обоих целевых генов и для всех обработок. Хотя и значимые, объяснительные значения эффектов кондиционирования (CD или DD; 16S рРНК: R² = 0,07, P < 0,001; acdS: R² = 0,04, P = 0,002) и системы земледелия (16S рРНК: R² = 0,05, P < 0,001; acdS: R² = 0,05, P < 0,001) на состав сообщества были сравнительно низкими. В общей сложности 60% общей дисперсии в составе общих прокариот и 46% дисперсии в составе сообщества acdS+ можно было объяснить отдельными эффектами присутствия растений, кондиционирования водным дефицитом и системы земледелия, или их взаимодействием.

Таблица 1  Результаты PERMANOVA для состава генов 16S рРНК и acdS.

Состав ASV рассматривали для всех обработок, чтобы определить влияние растения (пшеница, ячмень и голая почва), системы земледелия (органическое и традиционное) и режима полива в фазу кондиционирования (CD и DD). Дополнительный анализ только обработок с ячменем и пшеницей использовали для анализа влияния вида растения на состав базового сообщества по гену 16S рРНК и сообщества acdS+. Значимые факторы (P < 0,05) выделены жирным шрифтом.

Поскольку сильное различие между отсутствием и присутствием растений маскировало потенциальные эффекты видовой принадлежности растений, образцы ризосферы были проанализированы отдельно от образцов голой почвы. В этом подмножестве три фактора объясняли 40% общей дисперсии в составе 16S рРНК и 37% общей дисперсии в составе сообщества acdS+. Видовая принадлежность растения (ячмень или пшеница) не влияла на общий состав бактериального сообщества, но оказывала значительное влияние на состав сообщества acdS+ (R² = 0,05, P = 0,002). Кроме того, система земледелия (R² = 0,11, P < 0,001) и кондиционирование водой (R² = 0,07, P < 0,001), а также взаимодействие между этими факторами значимо формировали состав сообщества acdS (Таблица 1), особенно для ячменя (Рисунок 4). Аналогичная закономерность была обнаружена для состава гена 16S рРНК, где кондиционирование (R² = 0,17, P < 0,001) и система земледелия (R² = 0,11, P < 0,001) были основными драйверами (Рисунок 4). Зависящие от культуры эффекты также были обнаружены для индексов Шеннона (дополнительный рисунок S3). Так, для ячменя самые низкие индексы разнообразия при сравнении всех обработок были обнаружены для обоих генов — acdS и 16S рРНК — в OF в условиях DD (P = 0,004 и P = 0,032 для генов acdS и 16S рРНК соответственно). Для пшеницы только индекс Шеннона генов 16S рРНК был отрицательно подвержен влиянию истории водного дефицита в OF, с более низким индексом в DD, чем в CD (P = 0,015). Напротив, индекс Шеннона сообщества acdS в ризосфере пшеницы положительно влиял на историю водного дефицита в CF (DD > CD, P = 0,02) и дополнительно на тип почвы при земледелии в DD (CF > OF, P < 0,001).

Рисунок 4  Неметрическое многомерное шкалирование, показывающее влияние системы земледелия и режима полива в фазу кондиционирования на каждую обработку растений. NMDS выполнено на вариантах ампликонных последовательностей (ASV) с использованием матрицы сходства Брея–Кёртиса. Маленькие кружки соответствуют геометрическому центру (центроиду) каждой обработки, а линии показывают расстояние от образцов до центроида. Данные анализа на основе гена 16S рРНК показаны на подрисунках a–c, а данные анализа гена acdS — на подрисунках d–f для ячменя (A,D), пшеницы (B,E) и горшков без растений (C,F). Результаты PERMANOVA указаны на каждом графике (n = 5 горшков). CF — традиционное земледелие, OF — органическое земледелие, CD — «однократный водный дефицит» (контрольные и засушливые условия), DD — «история водного дефицита» (засушливые условия и засушливые условия).

Распределение доминирующих родов бактерий по обработкам

20 наиболее обильных родов, идентифицированных в ризосфере пшеницы и ячменя, а также в образцах голой почвы, в среднем составляли 52,1% от общего числа ридов ампликонов гена 16S рРНК (дополнительный рисунок S4). Из них один род был отнесен к Archaea, а 19 родов — к Bacteria. Среди бактерий филум Actinobacteria был представлен шестью родами, а Proteobacteria — пятью родами. Другие филумы включали по два рода Gemmatimonadetes (Gemmatimonas и неклассифицированные Gemmatimonadaceae), Acidobacteria (Acidobacteria SG6 и RB41) и Chloroflexi (JG30 KF CM45 и KD4 96), а также по одному роду Verrucomicrobia (C. Udeobacter) и Bacteroidetes (неклассифицированные Chitinophagaceae). Относительная численность 20 наиболее обильных родов на основе гена 16S рРНК варьировала между обработками (дополнительная таблица S1). Как и для всего сообщества, трехфакторный ANOVA, выполненный для каждого из 20 наиболее обильных родов на основе гена 16S рРНК, показал, что присутствие/идентичность растения, а затем система земледелия и кондиционирование значимо формировали их распределение (дополнительная таблица S1, дополнительный рисунок S4). Роды из неклассифицированных Chitinophagaceae, Gemmatimonas и Acidobacteria subgroup 6 зависели только от присутствия растений, но не от системы земледелия или кондиционирования. Для обоих образцов ризосферы растений был обнаружен эффект земледелия для Rhodanobacter (OF > CF) и Glycomyces (CF > OF), а эффект кондиционирования — для C. udeobacter и Chloroflexi JG30-KF-CM45 (CD > DD), а также для Dyella и Nocardioides (DD > CD). Наконец, эффект земледелия и кондиционирования присутствовал в обеих ризосферах растений, с преобладанием неклассифицированных Nitrososphaeraceae, KD4 96 и неклассифицированных Solirubrobacterales в обработках CF и CD, а Sphingomonas и Streptomyces — в обработках OF и DD (дополнительная таблица S1).

Последовательности acdS из 20 наиболее обильных родов в ризосфере и голой почве в среднем составляли 92% от общего числа ридов (Рисунок 5). Последовательности были отнесены либо к Actinobacteria (79,6% всех ридов), либо к Proteobacteria (19,6% всех ридов). Actinobacteria были представлены 13 родами, распределенными по пяти различным порядкам: один род из Streptomycetales, пять родов из Micrococcales, два из Propionibacteriales, два из Pseudonocardiales, по одному из Geodermatophilales и Micromonosporales и группа неклассифицированных Actinobacteria. Семь родов, принадлежащих к Proteobacteria, соответствовали шести родам порядка Burkholderiales и одному из неклассифицированных Bacteria. Трехфакторный ANOVA показал, что 19 из 20 наиболее обильных родов acdS были значимо подвержены влиянию по крайней мере одного фактора (Рисунок 5 и дополнительная таблица S1), за исключением Burkholderia (Proteobacteria). Эти обильные роды сильно зависели от присутствия растений, но также от системы земледелия и кондиционирования, или их комбинированных эффектов. В отличие от анализа на основе гена 16S рРНК, только два рода зависели только от присутствия растений без прямого влияния земледелия или кондиционирования. Остальные 18 родов в ризосфере растений зависели от системы земледелия (пять родов), кондиционирования (четыре рода) или от обоих (восемь родов) (дополнительная таблица S1).

Рисунок 5  Распределение 20 наиболее обильных родов по всем обработкам на основе набора данных acdS. CF — традиционное земледелие; OF — органическое земледелие; B — ячмень; W — пшеница; BS — голая почва; CD — «однократный водный дефицит» (контрольные и засушливые условия); DD — «история водного дефицита» (засушливые условия и засушливые условия); n = 5 горшков.

Роды сообщества acdS+, реагирующие на историю водного дефицита в ризосфере

Ввиду более сильного влияния кондиционирования водой на бактерии acdS+ в ризосфере (Таблица 1), их более высокой относительной численности в ризосфере по сравнению с объемной почвой (P < 0,001) и гипотезы о том, что эта функциональная группа бактерий помогает растениям противостоять стрессовым условиям, голая почва не анализировалась для определения эффекта кондиционирования водным дефицитом. Численность неразреженных ASV ризосферы, представляющих не менее 0,05% ридов acdS+, что соответствовало 377 ASV с не менее чем 1400 ридами, была определена, и рассчитаны логарифмические отношения изменений (log2 fold change) между CD и DD (дополнительная таблица S2).

Для обоих растений и при обеих системах земледелия было обнаружено 122 ASV, реагирующих на кондиционирование (дополнительная таблица S2), включая 87 с кратностью изменения более двух (Рисунок 6). Результаты показали, что влияние кондиционирования на численность ASV acdS+ часто было специфичным для вида растения и системы земледелия (Рисунок 6). Гораздо более высокая численность ASV при кондиционировании водным дефицитом (DD) (log2 fold change < –12) была сильно связана с образцами из CF, особенно ASV, ассоциированных с Actinobacteria. Интересно, что значительно более высокая численность нескольких ASV, соответствующих Marmoricola sp., была обнаружена только в OF. Кроме того, некоторые ASV Actinobacteria были обнаружены только в DD (log2 fold change < –20), и эта закономерность наблюдалась независимо от системы земледелия. Напротив, ASV, обнаруженные только в обработках без кондиционирования засухой (CD, log2 fold change > 20), были обнаружены исключительно в обработках с пшеницей, независимо от системы земледелия.

Рисунок 6  Относительная численность ASV acdS+, значимо подверженных влиянию кондиционирования засухой. Таксоны идентифицированы с помощью DESeq2 при P < 0,05, и представлены логарифмические отношения изменений между соответствующими обработками. CF — традиционное земледелие; OF — органическое земледелие; CD — «однократный водный дефицит» (контрольные и засушливые условия); DD — «история водного дефицита» (засушливые условия и засушливые условия); n = 5 горшков.

Климатические прогнозы предполагают увеличение вероятности летних засух в Центральной Европе (Spinoni et al., 2018; Hari et al., 2020), что представляет угрозу для водоснабжения и питания растений. Предполагается, что эта угроза может быть смягчена полезными для растений ризобактериями (de Vries et al., 2020). Эффекты наследия засухи могут оказывать сильное влияние на функционирование почвы через долгосрочные адаптации в составе микробного сообщества и микробно-опосредованное функционирование растений. Впервые в данном исследовании проанализировано влияние повторяющихся засушливых условий на разнообразие и состав сообщества функциональной группы микроорганизмов acdS+, потенциально способствующих устойчивости растений к стрессу. Мы показали, что ризосферные прокариоты и особенно сообщество acdS+ адаптируются к ограничению воды. Влияние режима полива в фазу применения на микробные сообщества указывает на наследие водного дефицита.

Кондиционирование водным дефицитом структурирует микробное сообщество, особенно в ризосфере

В нашей первой гипотезе мы ожидали, что реакция микробных сообществ на кондиционирование водным дефицитом будет специфичной для засеянных и незасеянных горшков из-за отбора специфических микроорганизмов корнями. Наши результаты показывают, что это действительно так. Мы наблюдали, что присутствие растений было основным фактором, влияющим на разнообразие как генов 16S рРНК, так и acdS, и это отражалось в различных составах сообществ в голой почве и в ризосфере как ячменя, так и пшеницы. Мы хотели бы отметить, что мы не проводили анализ почвы за пределами ризосферы в засеянных горшках, что было бы важной дополнительной контрольной обработкой. Из-за сильного отбирающего действия растений в сочетании с адаптацией к условиям водного стресса микробное сообщество, как предполагается, менее сложно в ризосферной почве (Mendes et al., 2014), что было подтверждено более низким разнообразием (индекс Шеннона) как общего бактериального, так и микробного сообщества АЦК-деаминазы в обработках с ризосферой по сравнению с голой почвой. Однако, несмотря на это сниженное разнообразие, сдвиги сообщества, индуцированные кондиционированием водным дефицитом, были более очевидны в ризосфере, чем в голой почве. Поскольку корневая экссудация изменяется в условиях засухи (Preece and Peñuelas, 2016), эти результаты предполагают специализацию таксонов, рекрутируемых в ризосферу, для помощи растению в преодолении стресса.

Системы земледелия отбирают таксоны после повторяющихся засушливых событий

Почвы при органическом земледелии часто являются резервуаром более высокого микробного разнообразия и активности по сравнению с почвами при традиционном земледелии из-за более высокого содержания органического углерода (Lori et al., 2017; Harkes et al., 2019), что может приводить к более сильной полезной для растений реакции на стресс. Однако, вопреки нашей второй гипотезе, мы обнаружили, что несколько таксонов были обогащены в ризосфере растений при традиционном земледелии после кондиционирования водным дефицитом. Аналогично, в то время как разнообразие сообщества acdS+ снижалось в ризосфере при органическом земледелии в DD, в CF в DD оно возрастало. Примечательно, что это более высокое разнообразие полезных для растений таксонов acdS+ при традиционном земледелии не было заметно на уровне всего бактериального сообщества, что предполагает, что растения в условиях водного дефицита специфически отбирают полезные для растений организмы для противодействия стрессу.

Эти специфические для типа земледелия эффекты на микробные сообщества согласуются с видами-индикаторами, идентифицированными из сельскохозяйственных почв после кратковременного засушливого стресса Кунделем с соавт. (Kundel et al., 2020). При умеренной засухе растения выделяют больше органических кислот в корневые экссудаты, особенно засухоустойчивые (Song et al., 2012). Органические кислоты стимулируют микробную активность в ризосфере (Macias-Benitez et al., 2020). В наших образцах при традиционном земледелии растения имели лучшую приспособленность благодаря внесению удобрений в CF, что могло привести к более высоким скоростям выделения этих органических кислот и к отбору полезных для растений бактерий с АЦК-деаминазой после повторяющегося периода водного дефицита. Следовательно, таксоны acdS+, специфически обогащенные в ризосфере после кондиционирования водным дефицитом, потенциально являются хорошими индикаторами микробов, адаптированных к засухе.

История водного дефицита и системы земледелия сильно влияют на сообщество acdS+ в ризосфере

Большинство доминирующих микробных таксонов подвергались влиянию кондиционирования водным дефицитом, что может быть удивительным, поскольку не все микробные особи внутри рода имеют схожие функции, и эффект конкретной обработки может быть разбавлен на определенном филогенетическом уровне. В фазу кондиционирования прогнозируемая численность генов, связанных с АЦК-деаминазой, была выше в сообществах органического земледелия при хорошем поливе по сравнению с засушливой обработкой (Breitkreuz et al., 2021). Это различие в численности не наблюдалось в образцах DD органического земледелия для ячменя или пшеницы в настоящем исследовании. Однако, предположительно, как результат этого, индекс Шеннона был ниже в органическом земледелии DD, особенно в ризосфере ячменя. Это предполагает, что сообщество acdS+ уже подвергалось отбору во время фазы кондиционирования, особенно из-за ограничения воды в органическом земледелии, и некоторые менее обильные таксоны могли быть уже отобраны, а их доли увеличены. Следовательно, отбор в фазу кондиционирования мог привести к снижению индекса Шеннона в фазу применения, что было дополнительно усилено гетероспецифической обратной связью «растение–почва», то есть сменой растения с пшеницы в фазе кондиционирования на ячмень в фазе применения.

В этом исследовании мы обнаружили несколько ASV из acdS+ Proteobacteria и Actinobacteria, обогащенных кондиционированием водным дефицитом в почвах традиционного земледелия. Proteobacteria обычно описываются как менее обильные после засушливого стресса. Действительно, после фазы кондиционирования численность видов, принадлежащих к филумам Acidobacteria, Chloroflexi, Firmicutes и Latescibacteria, значительно увеличилась в условиях засухи, в то время как Proteobacteria снизилась (Breitkreuz et al., 2021). Эта отрицательная тенденция может уравновешиваться свойствами, способствующими росту растений, которыми часто обладают Proteobacteria, такими как АЦК-деаминаза. По этой причине Proteobacteria обычно инокулируют на растения для повышения устойчивости к засушливому стрессу. В соответствии с нашими результатами, обогащение acdS+ Variovorax paradoxus в условиях засухи, а также его полезное влияние на рост растений при засухе уже было показано (Belimov et al., 2009; Teijeiro et al., 2019). Некоторые Actinobacteria также были более обильными после кондиционирования водным дефицитом. Буффо с соавт. (Bouffaud et al., 2018) уже описывали доминирование acdS+ Actinobacteria в ризосфере, и их последовательное обогащение в почве при засухе установлено (Hartman and Tringe, 2019), поскольку они в основном известны как засухоустойчивые благодаря прочной клеточной стенке и избеганию засухи путем спорообразования (Pérez Castro et al., 2019). Род Streptomyces был самым обильным родом acdS+, и его численность усиливалась кондиционированием при ограниченной воде. Представители этого грамположительного рода характеризуются как засухоустойчивые и полезные для растений (Schrey and Tarkka, 2008; Breitkreuz et al., 2020), что мы также подтвердили в нашем исследовании. Мы особенно идентифицировали ASV, соответствующие нескольким видам Streptomyces, обогащенных кондиционированием ограничением воды, включая S. mutabilis, S. resistomycificus, S. scabiei и S. viridochromogenes. Эти виды Streptomyces обладают высоким потенциалом влияния на рост пшеницы и ячменя. S. viridochromogenes охарактеризован как продуцент гербицида фосфинотрицин-трипептида (Schwartz et al., 2004), тогда как S. mutabilis способствует росту пшеницы и устойчивости к болезням (Toumatia et al., 2016). И наконец, биология S. scabiei сложна и специфична для изолята; в то время как патогенные штаммы S. scabiei продуцируют такстомины и подавляют защитные реакции растений, вызывая снижение роста и образование парши у картофеля (Bignell et al., 2010), другие штаммы того же вида продуцируют стауроспорин и эффективно контролируют корневую гниль пшеницы (Wen et al., 2012). Однако их положительное влияние на растение в условиях засухи еще не описано.

Влияние видовой принадлежности растения

Хотя влияние видовой принадлежности растения на общее сообщество было сравнительно низким, оно оказывало сильное воздействие на сообщество acdS+, как предполагалось в нашей третьей гипотезе. Это указывает на сильный отбор со стороны вида растения, вероятно, вызванный дифференциальной ризодепозицией. Корневые экссудаты пшеницы, как описано, значительно отличаются от таковых у ячменя, особенно по содержанию и составу доминирующих мугинеевых кислот, а также по относительным количествам аминокислот (Fan et al., 2001). Растения пшеницы, по-видимому, меньше подвержены влиянию кондиционирования водным дефицитом, что отражается в сходной высоте растений в двух обработках. Ассоциированные микробные сообщества демонстрировали даже более высокие индексы разнообразия при традиционном земледелии. Одно из объяснений может заключаться в использовании озимой пшеницы в качестве модельного растения в первый год эксперимента, т. е. в фазу кондиционирования. Близкое родство между озимой и яровой пшеницей, вероятно, отбирающее специфически адаптированные таксоны, могло способствовать росту яровой пшеницы больше, чем ячменя в фазу применения. Это означает, что при смене культуры положительный эффект истории водного дефицита снижался. Аналогично, Кайзерманн с соавт. (Kaisermann et al., 2017) обнаружили, что эффекты наследия засухи на рост растений были наиболее сильными в почвах, скондиционированных тем же видом растений.

Объясняет ли нишевый отбор историю водного дефицита?

Различия в водоснабжении применялись в течение кондиционирования (25 против 60% WHC) и постоянный водный дефицит (25% WHC) в течение фазы применения. Эффекты наследия засухи на бактериальные сообщества сообщались как после повторяющихся засушливых периодов (Evans et al., 2014; Bastida et al., 2017), как в нашем эксперименте, так и после прекращения засухи (de Vries et al., 2018). Хорошо обоснованным объяснением изменений в микробном составе в ответ на хронически низкую влажность почвы является нишевый отбор (Evans et al., 2014), приводящий к обогащению таксонов, устойчивых к засухе, по сравнению с чувствительными к засухе. В результате целые почвенные микробные сообщества могут со временем развивать засухоустойчивость (Bastida et al., 2017), что может приводить к повышенным уровням микробной активности при низкой влажности почвы. Когда изменения вводятся в контексте растительного сообщества и обратной связи «растение–почва», изменения могут в конечном итоге поддерживать полезное влияние ризосферных организмов на рост растений (Canarini et al., 2021). В соответствии с концепцией голобиома расширенного фенотипа растений, эти последовательные стадии отбора могут способствовать общей приспособленности растений при засушливом стрессе (Liu et al., 2020). Наши данные поддерживают идею нишевого отбора двумя последовательными засушливыми периодами и предполагают, что устойчивость сообщества acdS+ поддерживается высокодинамичной структурой сообщества. Эта высокая динамика согласуется с нашими наблюдениями за сообществом acdS+ в ризосфере кукурузы; они сильно модулировались типом почвы, но также глубиной почвы (Gebauer et al., 2021) и стадией развития кукурузы (Renoud et al., 2020).

Мы продемонстрировали, что водный дефицит может индуцировать модификацию сообщества специализированных полезных для растений прокариот, которая остается обнаруживаемой в течение последующего периода низкой влажности почвы в следующем году. Этот результат дополняет информацию о ризосферном микробном отборе под действием засухи и подчеркивает, что бактерии, стимулирующие рост растений, могут быть особенно чувствительны к абиотическому стрессу. Будущие исследования должны быть направлены на то, как долго сохраняется различие между скондиционированными и нескондиционированными сообществами и исчезает ли оно после периода оптимального полива. Представители сообщества acdS+ отбирались главным образом из пулов видов протеобактерий и актинобактерий, которые в общем сообществе составляли большинство микроорганизмов, ассоциированных с ризосферой. Представители многих идентифицированных таксонов могут быть легко выделены культивированием, и эксперименты с синтетическими сообществами позволят выявить их функциональный потенциал. Тот факт, что реакции различаются в голой почве и ризосфере и дополнительно модулируются условиями земледелия, подчеркивает контекстную зависимость реакций сообществ, но также указывает на то, что изменение структуры сообщества может смягчать негативные последствия водного дефицита. Таким образом, будущие исследования должны выяснить, как эти адаптированные к засухе ризосферные сообщества acdS+ представляют активность АЦК-деаминазы и поддерживают продуктивность растений. Это может быть использовано для определения критических точек, пороговых значений остроты водного дефицита или продолжительности, при которых даже адаптированное к стрессу сообщество не может поддерживать рост растений.

Дополнительный материал к этой статье можно найти онлайн по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2022.824437/full#supplementary-material

Gebauer L, Breitkreuz C, Heintz-Buschart A, Reitz T, Buscot F, Tarkka M and Bouffaud M-L (2022) Water Deficit History Selects Plant Beneficial Soil Bacteria Differently Under Conventional and Organic Farming. Front. Microbiol. 13:824437. doi: 10.3389/fmicb.2022.824437

Перевод статьи «Water Deficit History Selects Plant Beneficial Soil Bacteria Differently Under Conventional and Organic Farming» авторов Gebauer L, Breitkreuz C, Heintz-Buschart A, Reitz T, Buscot F, Tarkka M and Bouffaud M-L., оригинал доступен по ссылке. Лицензия: CC BY. Изменения: переведено на русский язык

Фото: Designed by Freepik